[发明专利]用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒，包括Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物。通过实验证明：本发明的试剂盒可以快速准确的鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis以及Monilia polystroma。本发明的试剂盒不仅能够满足病害防治及口岸检疫部门对褐腐病菌快速、准确鉴定方法和技术的迫切需求，也为病害防治及检验检疫提供技术支持和决策参考，具有重要的推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定核果和仁果上六种褐腐病菌的实时荧光PCR检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

褐腐病(Brown Rot)是桃、杏、樱桃等核果及苹果、梨等仁果上重要的病害。褐腐病可以危害多种核果仁果植物引起花腐、枝干溃疡、果实腐烂等不同症状，其中危害最严重的是造成产中和产后的果实腐烂。2001年，美国南部的乔治亚州桃上褐腐病大面积发生，造成的直接经济损失达430万美元，由于防治褐腐病购买杀菌剂带来的间接经济损失为150万美元(Phillips,2002)。根据对北京地区桃褐腐病的调查发现，桃褐腐病的发病率为20％，严重时发病率达100％，严重影响果实的食用价值和果农的经济收入(陈笑瑜等，2003)。其它地区也经常报道褐腐病的发生和危害(林永安等，2004；孙宝海，2006；毛立仁等，2007)。

褐腐病的病原菌为链核盘菌属(Monilinia)，分类上属于子囊菌门(Ascomycete)，盘菌纲(Discomycete)，柔膜菌目(Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)；无性态属于串珠霉属(Monilia)。根据最新的研究进展，目前世界上已经发现了6种褐腐病菌：Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilia polystroma、Monilia mumecola以及Monilia yunnanensis。这些褐腐病菌在世界各地的分布不同，M.fructicola主要分布在北美和亚洲地区，仍然是欧州地区的重要检疫对象。M.fructigena主要分布在欧州。M.laxa分布在欧洲、北美洲。在我国，发现了所有世界上已经报道的种类，普遍存在M.yunnanensis，在一些地区发现了M.fructicola、M.polystroma，在局部地区也发现了M.mumecola。M.fructigena和M.laxa仅在新疆的野果林中检测到。因此，一些种群属于国际间或国内地区间的检疫对象。我国是桃、苹果、梨等核果仁果重要的进出口国家，随着各国果品贸易的不断加强，急切需要加强对褐腐病菌的检疫工作。

褐腐病菌的准确检测和鉴定显得尤为重要。几种褐腐病菌的形态特征非常相似，缺少经验时很难准确判断。近年发展起来的分子生物学技术也在褐腐病菌的种类鉴定中得到了广泛应用(Ioos et al.,2000；Hughes,et al.2000；Ma et al.,2003；Cote et al.,2004；Gell et al.,2007)。但根据文献报道以及本研究小组的测试，这些方法都不能用于准确鉴定6种褐腐病菌。在6种褐腐病菌中，M.mumecola与M.laxa最相近，M.yunnanensis与M.polystroma和M.fructigena最相近，在褐腐病菌的鉴定中难以区分。

Real-time PCR方法是近年发展起来可用于快速检测病原菌的分子方法，目前在褐腐病菌的研究中已经开发用于检测Monilinia fructicola、M.laxa等。目前仍然缺少区分6种褐腐病菌的Real-time PCR检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定褐腐病菌。