[发明专利]棕点石斑鱼精子超低温冷冻保护剂及其保存方法

说明书

本发明公开了一种棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存剂，为包含二甲亚砜和葡萄糖的水溶液，pH为7.5，渗透压为328mOsmol/Kg，每1升水溶液中含100毫升二甲亚砜和60.1克葡萄糖。本发明还公开了棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存方法，将精液与冷冻保护剂等体积混合，灌装入麦管后平行放置在液氮面3‑5cm处停留8‑10分钟，然后直接投入液氮中保存。本发明的冷冻保存剂配制简单、成本低，而且只有两种不发生反应的成分，减轻了冷冻保存剂本身对精子的不良影响。而保存方法可以弥补目前棕点石斑鱼尚未有相关保存技术的不足。

技术领域

本发明涉及石斑鱼类的精子冷冻保存剂，尤其涉及棕点石斑鱼精子超低温冷冻保护剂。同时，本发明还涉及棕点石斑鱼精子超低温冷冻保护保存方法。

背景技术

棕点石斑鱼是名贵海产鱼类，肉质鲜美，营养丰富，经济价值很高，其自然资源由于过度捕捞和环境破坏，已被世界自然保护联盟 (IUCN) 列为“易危”等级。为缓解捕捞压力和满足市场需求，我国广东、海南、福建等地大规模开展人工养殖，目前棕点石斑鱼已经成为南方重要的海水养殖鱼类。但在生产实践中，由于棕点石斑鱼雄鱼需要4～5年才能性成熟，且存在雌、雄亲鱼性成熟不同步的问题，不利于苗种的稳定供应，严重制约了养殖业的发展。

超低温冷冻保存技术是解决这一问题的有效手段。将性成熟的棕点石斑鱼雄鱼精液收集并超低温冷冻长期保存，根据生产需要随时使用，克服了雄鱼不足及雌雄性成熟不同步等问题，保障了苗种的供给。然而，迄今尚未见棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存的研究报道，而且由于不同种鱼类精子的生理特性差别很大，利用已报道其它石斑鱼类的冷冻保护剂及方法保存棕点石斑鱼的精子效果并不理想。

超低温冷冻保存剂是决定保存效果的关键，目前主要是采用渗透性抗冻剂（甲醇、甘油、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙二醇和丙二醇等）或非渗透性抗冻剂（海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、羟乙基淀粉、白蛋白、抗冻蛋白、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等），与盐溶液（NaCl、Na₂CO₃、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、MgCl₂、MgSO₄、KCl、CaCl₂等）和营养液（氨基酸、维生素等）混合配制。然而，成分复杂的冷冻保存剂不仅配制困难、成本高，而且各成分之间还可能会发生反应，对精子有一定的毒性，反而影响了保存效果。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种成分简单有效的棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存剂，解决目前采用成分复杂冷冻保存剂存在的毒性及配制难、成本高等问题。

本发明实现目的之一的技术方案如下：棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存剂，为包含二甲亚砜和葡萄糖的水溶液，PH为7.5，渗透压为328mOsmol/Kg，每1升水溶液中含100毫升二甲亚砜和60.1克葡萄糖。

在本发明中，主要由渗透性抗冻剂二甲亚砜和非渗透性抗冻剂葡萄糖构成。葡萄糖为非渗透性抗冻剂，不能穿过细胞膜进入到精子内部，可以稳定细胞质膜，在细胞外降低溶质浓度，减少溶质损伤程度，在冷冻前就使细胞脱水而减少胞内冰晶形成。二甲亚砜为渗透性抗冻剂，可进入精子内部降低溶液冰点，防止大的冰晶形成，二者结合可提供良好的冷冻效果。

本发明的目的之二在于提供操作简单有效的棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存方法，弥补目前棕点石斑鱼尚未有相关保存技术的不足。

本发明提供的棕点石斑鱼精子超低温冷冻保存方法，将精液与冷冻保护剂等体积混合，灌装入麦管后平行放置在液氮面3-5cm处停留8-10分钟，然后直接投入液氮中保存。所述精液与冷冻保护剂混合物冻存体积为0.25-0.5ml。

本发明所述保存方法还包括解冻步骤，在解冻时将冷冻在液氮中存有精子的麦管取出，30-40℃水浴6-20秒(s)。