[发明专利]一种穿心莲多倍体诱导方法

说明书

本发明涉及一种穿心莲多倍体诱导方法，该方法以穿心莲丛生芽为诱导材料，经含有100～2000mg·L^‑1的秋水仙素和1％二甲基亚砜的溶液进行预处理，用无菌水洗干净后，转接到相应培养基继续培养，根据生长状况不断更换培养基，获得多倍体丛生芽，再经生根、练苗培养获得正常生长的植株。本发明首次以穿心莲腋芽组织再生的丛生芽为诱导材料，结合所采用的诱导培养方法，显著提高了穿心莲多倍体的诱导率，高达62.86％，成活率79.05％，以及降低了嵌合体的发生率。获得的穿心莲四倍体叶面积、茎等都较二倍体巨大，有利于提高穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的产量，满足人们对穿心莲药材及其相关产品的需求。

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，具体涉及一种穿心莲多倍体诱导方法。

背景技术

穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.F.)Nees)的干燥地上部分，临床用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮等，其化学成分主要是穿心莲内酯类和黄酮类化合物。穿心莲内酯类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗癌、抗肿瘤等作用，也是多种名优中成药产品(穿心莲片、消炎利胆片等)的原料药材。商品药材主产广东、福建，行销全国。

穿心莲植物主要以植物的营养器官为收获对象供药用，为此非常适宜采用多倍体诱导的方法来提高产量和质量。因为植物染色体经过加倍后，均表现出营养器官“巨大性”特征，也能很好地满足以植物营养器官(根、茎、叶)为收获对象的药材生产要求，提高药材产量。另外，由于植物细胞染色体加倍后，染色体上基因调控有效化学成分含量也较正常二倍体明显增高，所以对穿心莲药用植物进行多倍体诱导对于提高有效成分的产量十分有利。

多倍体植物在形态特征、生理生化特性及产量、品质等方面都有所变化，其中有一些优良特性是二倍体所没有的，因而被广泛应用于植物育种工作中。多倍体诱导方法早期研究主要采用原位诱导法，即把供试植物的种子、正在生长的幼苗、茎尖等在非离体条件下用不同浓度的诱变剂处理，从而诱导染色体加倍。处理的方法有浸泡法、注射法、涂抹法及包埋法等。尽管这些方法都能获得多倍体，但往往存在嵌合体几率高的现象。近年来随着生物技术的发展，离体培养加倍法开始盛行，从已有报道来看，该方法的主要途径有两条：一是在组织培养过程中，用秋水仙素水溶液直接处理培养材料；二是用含有秋水仙素的固体培养基将材料培养一段时间，再转入分化培养基，再由变异细胞分化出完整植株。离体加倍培养法由于试验条件易于控制，变异植株受环境影响造成的回复突变现象减少，试验结果重复性强，在多倍体诱导中普遍采用。

然而，多倍体诱导中还存在一些亟待解决的问题：首先，秋水仙素虽然是目前使用最多，最为有效的化学诱导剂，但其价格较贵且有剧毒，对植物来说它是人为增加的环境胁迫因素，在一定条件下可以使植物细胞内部环境发生改变，促使细胞内产生的ROS无法正常消除而使细胞凋零。其次，经诱变处理后并不是所有分生细胞的染色体数都同样的加倍，有可能是某些细胞加倍了，而有的细胞没加倍而导致出现嵌合体，嵌合体现象给多倍体育种带来困难，使得真正同一倍性水平的多倍体频率过低。

多倍体诱导中，诱导材料的选择主要有：愈伤组织，不定芽，丛生芽，茎尖，种子，子叶和叶片，根部等。其中丛生芽是由植物器官和愈伤组织发育出来的群体丛生芽苗，大多是多细胞形成，双极性，结构完整，可直接形成小植株，成苗率高，是植物多倍体育苗较佳的材料。目前国内没有以穿心莲丛生芽诱导多倍体育苗的相关报道。为此，以穿心莲丛生芽为材料，通过改善诱导条件，降低秋水仙素的诱导浓度，减轻其对细胞的毒害作用，提高成活率，同时降低嵌合体发生率，为改良穿心莲的遗传育种工作提供实践指导。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过选取特定的诱导材料、改进诱导和培养方法，建立了一种诱导率高、嵌合体发生率低的穿心莲多倍体的诱导方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种穿心莲多倍体诱导方法，其包括以下步骤：