[发明专利]均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法

权利要求书

1.均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

所用试剂包括：

MgCl₂，10×PCR反应缓冲液，dNTPs，EGFR等位基因19外显子DNA引物，EGFR等位基因19外显子E746-A750，2236到2250位碱基的15bp缺失突变DNA的FAM标记探针、EGFR等位基因19外显子E746-A750，2236到2250位碱基的15bp野生型DNA的R110标记探针，模板：待检测样品DNA，阴性对照标准品即pGEM-T-easy空载体、阳性对照标准品即EGFR等位基因19外显子野生型对照标准品与19外显子突变型对照标准品的混合物，浓度均为1000拷贝/ml；

对试剂分别进行扩增，然后对扩增产物分别进行FAM和R110荧光偏振值的检测，阳性对照标准品FAM和R110荧光偏振值分别大于阴性对照标准品FAM和R110荧光偏振值30mp以上则为扩增成功，根据待检测样品FAM和R110荧光偏振值与阳、阴性对照标准品的差值高低变化和比值判读待检测样品的EGFR等位基因19外显子突变指数。

2.根据权利要求1所述的均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

扩增反应在25uL体系中进行，加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度均为2.0mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，DNA聚合酶1-2单位，浓度为1.5-3.0mM MgCL₂。浓度均为0.5uM的EGFR基因19外显子上游引物和3’端带荧光标记的2种探针,浓度0.1uM-0.05uM的EGFR等位基因19外显子下游引物；5μL模板DNA；

PCR缓冲液是1.0U Taq polymerase。

3.根据权利要求1所述的均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

据EGFR等位基因GenBank序列，设计合成覆含EGFR等位基因19外显子E746-A750的引物及19外显子野生型、突变型探针：

EGFR19正向引物5'-gtgcatcgctggtaacatcc-3'；

EGFR19反向引物5'-gaagcaacatctccgaaaagc-3'；

19外显子野生型探针：5’-gagggaattaagagaagctc–R110 3’；

19外显子突变型探针：5’-gccaaaacatctccggc-FAM 3’。

4.根据权利要求1所述的均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

扩增反应条件为：94℃变性5min后，95℃孵育1秒，60℃孵育1秒，72℃孵育10秒，45个循环，最后一个循环无72℃孵育。

5.根据权利要求1所述的均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

分别扩增EGFR等位基因19外显子阴性对照标准品模板即pGEM-T-easy空载体、阳性对照标准品模板即EGFR等位基因19外显子野生型对照标准品1000拷贝/ml+19外显子突变型对照标准品1000拷贝/ml、及待测DNA样品，分别获得EGFR等位基因19外显子目的基因扩增产物。

6.根据权利要求1所述的均相检测EGFR等位基因19外显子突变指数的方法，其特征在于：

所述方法分别检测阴性对照标准品、阳性对照标准品及待测样品EGFR等位基因19外显子目的基因的最终扩增产物的FAM和R110荧光偏振值；

阳性对照标准品R110、FAM荧光偏振值分别大于阴性对照标准品R110、FAM荧光偏振值30mp以上则为扩增成功；

待测样品的EGFR等位基因19外显子突变指数＝{〔待测样品的FAM荧光偏振值-(阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值)〕/(阳性对照标准品FAM荧光偏振值-阴性对照标准品FAM荧光偏振值)}÷{〔待测样品的R110荧光偏振值-(阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值)〕/(阳性对照标准品R110荧光偏振值-阴性对照标准品R110荧光偏振值)}。