[发明专利]多重免疫荧光检测小鼠六种病毒的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了多重免疫荧光检测小鼠六种病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明将多重RT‑PCR技术和Luminex液相芯片技术相结合，设计了可同时检测小鼠TMEV、MHV、MNV、Reo‑3、MVM、MPV这六种高感染率病毒的引物组，利用该引物组通过特定PCR获得目标扩增产物，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，通过Luminex检测仪读取MFI值时，从而分辨不同类型的病毒。该方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高、重复性好等有益效果，可应用于实验小鼠的质量监测、流行病学调查及早期预警。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病毒的种类。

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及多重免疫荧光检测小鼠六种病毒的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

实验动物微生物质量检测是评价实验动物质量的重要指标，微生物感染不仅对实验动物本身造成危害，对科研工作也造成潜在干扰。在实验动物感染疾病中，病毒性疾病占有重要的位置，在日常生物实验动物病原监测中我们发现，实验小鼠病毒感染多呈隐性感染，没有明显的临床症状，疫病诊断比较困难；而且动物感染病毒往往表现为持续性感染，设施一旦存在病毒感染比较难清除，需要通过检测和淘汰(test-and-removal)方法才能从受污染的设施彻底根除病毒，因此，建立快速高效的实验动物病毒检测方法，及时准确地发现病原感染，控制及清除疫情，对于提高实验动物质量非常重要。

实验小鼠病毒多达十几种，我国实验动物国家标准GB14922.2-2011中规定的SPF级小鼠需排除11种病毒。本发明中的小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s murineencephalomyelitis virus，TMEV)、小鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus,MHV)、小鼠呼肠孤病毒III型(Reovirus Type 3，Reo-3)和小鼠细小病毒MVM株(Minute virus of mice，MVM)是国家标准需要排除的病原。小鼠诺如病毒(Murine Norovirus，MNV)和小鼠细小病毒MPV株(Mouse parvovirus，MPV)是新发现的感染实验小鼠的病毒，这两种病毒是国外实验动物健康监测的一个必检项目，我国实验动物国家标准中虽然尚未把MNV和MPV列入检测项目，但是一些实验动物生产或使用单位、以及一些CRO公司都把其列为筛查项目。TMEV、MHV、MNV、MVM、MPV都是目前实验小鼠中感染率较高的病毒，2014年王翠娥等报道实验小鼠中抗体阳性率分别为15.1％(n＝325)、19.9％(n＝971)、42.2％(n＝329)、12.0％(n＝326)和1.3％(n＝390)。

目前，国内病毒感染诊断方法主要是针对抗体检测的血清学检测方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫酶试验(IEA)和免疫荧光试验(IFA)等，但是这些方法中不能应用于免疫功能低下或免疫缺陷小鼠如SCID小鼠和裸小鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反应。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方法既复杂又繁琐，不利于日常检测。传统的检测技术已不能满足实验动物质量检测需求，以PCR为基础的分子生物学诊断方法检测病毒具有快速、灵敏、特异等特点，是目前临床上检测和诊断疾病的常用检测方法。但普通PCR方法需要开盖对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化，而且容易产生气溶胶污染，导致出现假阳性。实时荧光定量PCR技术因高精确度，高灵敏性，污染少等优点是目前病毒感染诊断的重要手段。但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测，且实验成功的难度极大，成本也相对较高。

Luminex液相芯片技术是20世纪90年代兴起的一种新型的多重荧光免疫分析方法，该技术有机地整和了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项技术。与传统的临床检测方法相比，其主要优点在于可以自由组合、高通量、灵敏度高、重复性好、检测范围广、反应速度快、低成本、操作简便，既能检测蛋白又能检测核酸等。本发明利用Luminex液相芯片技术建立一种同时检测小鼠TMEV、MHV、MNV、Reo-3、MVM、MPV这六种高感染率的病毒的检测方法，该技术可应用于实验小鼠的质量监测、流行病学调查及早期预警。