[发明专利]D‑氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途

说明书

技术领域

本发明公开一种D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着口腔医学的不断发展和种植技术的日臻成熟,种植义齿已成为牙列缺损及牙列缺失患者的治疗首选。临床资料显示，虽然近十余年的种植义齿存留率已达97.1%，但其生物学并发症并无明显降低。种植体周围黏膜炎及其继发的种植体周围炎可引起局部肿胀不适、骨吸收甚至种植体松动脱落，其导致种植失败的病例约占失败总数的30％以上。大量资料显示，种植体周围黏膜炎发生的始动因素为种植体颈部菌斑生物膜的形成，生物膜中细菌对抗生素的耐药性近乎于浮游状态细菌的500倍。与天然牙相似，当种植体周发生炎症时，其主要菌群从G+菌转变为G-菌，其中牙龈卟啉单胞菌是被公认为与种植体周围炎症发生发展甚至种植体最终脱落关系最为密切的细菌。

目前，研究已证实了牙龈卟啉单胞菌（Porhyromonas gingivalis, P.g）在牙周炎、种植体周围炎等口腔疾病的发生、发展中发挥着重要的作用。临床上去除菌斑生物膜、控制种植体周围炎的方法主要有：机械处理、激光治疗、药物治疗和光动力治疗等。器械处理包括抛光杯、塑料、碳纤维或钛刮治器的使用以及超声洁治刮治和气压喷砂等。由于种植体表面粗糙多孔，机械治疗方法均不能彻底清除其表面的生物膜和细菌。另外，在使用器械操作时可能会引起钛表面的损伤或器械材料的残留，干扰机体细胞的再附着。激光治疗对种植体的长期影响尚不明确，实验显示不适当的波长可引起SLA或TPS钛表面的广泛熔化，这种热损伤可能会对种植体产生长期的潜在损害。葡萄糖酸氯己定被认为是抗微生物药物中的“金标准”，它虽能有效地降低细菌的活性，却不能破坏生物膜；长期抗生素的使用还会导致部分菌株耐药性的产生。光动力抗菌疗法是治疗种植体周围炎的一种前沿方法，其抗菌机理是光化学反应引起细菌胞浆膜的破坏，但实验显示该疗法并不能破坏生物膜的完整性，因此不能彻底清除细菌。

经检索相关文献，临床上仍没有一种能够有效清除生物膜的技术或制剂，如何有效地清除种植体表面的生物膜成为预防和治疗种植体周围炎的技术关键。抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的药物及制剂的开发将有助于预防及治疗由牙龈卟啉单胞菌参与引起的口腔疾病。研究结果可能为临床上预防和治疗种植体周围炎新药的研制提供理论依据。

组成地球生命体的氨基酸绝大部分是L-氨基酸，而近年来有研究发现D-氨基酸也存在于人体、动植物以及微生物的体内，但是关于D-氨基酸对于细菌生物膜形成的作用是未知的。

发明内容

本发明公开一种D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途，利用D-氨基酸对于细菌生物膜的破坏作用，使D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成具有抑制作用，可以应用于防治牙龈卟啉单胞菌引起的牙周炎、种植体周围炎等疾病。

本发明通过外源性D-氨基酸作用于细菌生物膜形成期，进行细菌生物膜形成状态的观察，证明了D-氨基酸具有明显的抑制细菌生长及生物膜形成的作用。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用了如下的技术路线：

利用有效D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成进行实验，采取结晶紫及胞外多糖实验实验及扫描电子显微镜进行结果验证。

牙龈卟啉单胞菌的鉴定：通过革兰染色观察细菌形态并通过16Sr RNA PCR进行牙龈卟啉单胞菌特定引物序列的鉴定，

上游引物：5‘-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，

下游引物：5‘-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

本实验中，实验组为梯度浓度的D-氨基酸与对数期的牙龈卟啉单胞菌菌液共培养，对照度为空白培养基与对数期的牙龈卟啉单胞菌菌液共培养。

牙龈卟啉单胞菌的培养：将牙龈卟啉单胞菌接种到液体BHI培养基中，于恒温培养箱内进行厌氧培养，分别于培养的第24小时、28小时……72小时，每4小时利用分光光度计测定吸光度值（OD值），绘制生长曲线，结果显示48小时时，牙龈卟啉单胞菌生长进入对数生长期，72小时时达到高峰。

D-氨基酸的配制：用电子分析天平秤取一定量的粉状D-氨基酸，溶于无菌去离子水后，用0.22um滤菌器过滤除菌，备用。

通过结晶紫染色法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜聚集量，结果显示高浓度D-氨基酸能明显抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的聚集。

通过苯酚-硫酸法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜分泌的胞外多糖，结果显示高浓度D-氨基酸能明显抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。