[发明专利]一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞遗传学技术领域，具体涉及一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法。

背景技术

染色体是细胞核中最重要的组成部分，染色体数目和结构的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源。根尖细胞有丝分裂中期制片是一项基本的细胞遗传学研究技术和手段，该技术以及以此技术为基础的核型分析和荧光原位杂交等技术在物种鉴定和鉴别、物种间亲缘关系确定、物种倍性鉴定和杂交育种等研究中有广泛的应用。

石刁柏俗名芦笋，隶属于百合科天门冬属，其嫩茎富含氨基酸、蛋白质和维生素等多种营养成分，是世界著名蔬菜之一，在国际上享有“蔬菜之王”的美誉。石刁柏是典型的雌雄异株植物，其遗传组成为2n=2x=20。石刁柏的性别是由性染色体决定的，具有XX性染色体的表现为雌性，而具有XY性染色体的表现为雄性，但是，其X和Y染色体为同型的。近年来，对石刁柏的研究主要集中在营养成分、分子生物学研究等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于石刁柏的细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，染色体容易拖尾且染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。并且，尽管石刁柏根尖的分生组织区分裂活动比较旺盛，但分裂中期的细胞仅占据很少一部分，大部分细胞仍处于间期，这为获得理想的染色体制片造成了很大障碍，往往需要进行大量的染色体制片才能挑选出少量理想的可用于分析及后期实验的玻片，浪费大量的人力、物力和时间。诱导植物细胞周期同步化可以使处于分裂中期的细胞比例大大增加，使染色体制片的成功率和稳定性大大提高。但是对于石刁柏，甚至天门冬属还没有相关的报道。目前最常用的方法是采用羟基脲（HU）和甲基氨草磷（APM）双阻断法诱导植物细胞有丝分裂同步化，可获得高频率有丝分裂中期指数。但是，HU和APM都有毒性，并且经APM处理后，石刁柏根尖细胞染色体容易拖尾，形态不好，不利于进行后期更深入的研究和分析。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：采用羟基脲和N₂O双阻断法诱导石刁柏细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞，再经低渗、固定和制片步骤大量获得形态清晰、分散良好且适用于后续细胞学研究的染色体玻片标本。

本发明所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）根尖培养：将石刁柏种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.8-1.5cm；

（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为2.5mmol/L的羟基脲处理根长为0.8-1.5cm的石刁柏种子18h；

（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖4-6h；

（4）N₂O预处理：切取根尖放入N₂O气室中处理1-3h；

（5）低渗：用摩尔浓度为0.075mol/L的KCl溶液处理30-90min；

（6）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min；

（7）滴片：固定后用去离子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生组织区，置于质量分数为1%的果胶酶和质量分数为2%的纤维素酶的混合液中，37℃酶解2h，酶解完成后加入TE缓冲液反复吹打以去除根冠和根尖外层组织，然后用体积分数为70%的乙醇洗根尖两次，在40μL乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μL无水乙酸，混匀后吸5-8μL滴片，室温放置5min后即可镜检。

进一步优选，步骤（1）中石刁柏根长优选为1cm。

进一步优选，步骤（3）中清水培养根尖的时间优选为5h。

进一步优选，步骤（4）中N₂O的处理压强为1.01MPa，N₂O的处理时间优选为2h。

进一步优选，步骤（5）中KCl溶液的处理时间优选为60min。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、使用HU可使细胞阻断在分裂间期，去除HU后进行恢复培养，可诱导细胞进行同步化，经过5h的恢复培养，使大量细胞位于细胞分裂的中期，经预处理、固定及压片后，有丝分裂中期细胞的比例大大增加；