[发明专利]一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是嗜水气单胞菌的技术领域，具体的说是一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法。

背景技术

在对虾的流行病学研究基础上，确立出白斑综合症病毒(WSSV)、弧菌和嗜水气单胞菌是山东省虾蟹养殖的重要病原，如何快速的检测出对虾中的嗜水气单胞菌是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供了一种嗜水气单胞菌的Lamp检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法，其步骤是：

1、嗜水气单包菌菌种的培养；

2、嗜水气单胞菌染色体DNA的提取；

3、引物的设计；

4、提模板；

5、LAMP反应体系的建立。

进一步，所述嗜水气单包菌菌种的培养方法是：(1)、取保藏的嗜水气单胞菌在营养肉汁琼脂平板培养基中进行平板划线分离单菌落，放入恒温箱28～30℃倒置培养24h；(2)挑取单菌落接种至3ml的液体培养基(试管)中，放入28～30℃100r/min摇床培养12h；(3)将试管中培养的菌转接入120ml的液体培养基中相同条件下培养12h，4℃下保存备用。

进一步，所述嗜水气单胞菌染色体DNA的提取方法是：移液枪取一嗜水气单胞菌菌落,接种于营养肉汤,于28℃培养18～24h。

进一步，所述提模板的方法是：取1ml嗜水气单胞菌染色体DNA培养液于离心管中，12000r/min离心5min，去掉上清液然后加入100ul无菌水混合，100℃水浴加热10min，冰浴2min，12000r/min离心5min，保留上清液备用。

进一步，所述LAMP反应体系的建立包括温度实验、时间实验、对照实验、敏感性实验、特异性实验。

本发明的有益效果为：检测速度块，检测准确，有效诊断对虾中的致病细菌，提前做好针对性的准备，防止对虾感染，从而预防对虾病害的发生。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法，其步骤如下：

1、嗜水气单包菌菌种的培养：

(1)取保藏的从养殖对虾体内分离的嗜水气单胞菌，在营养肉汁琼脂平板培养基中进行平板划线分离单菌落，放入恒温箱28～30℃倒置培养24h。

(2)挑取单菌落接种至3ml的液体培养基(试管)中，放入28～30℃100r/min摇床培养12h。

(3)将试管中培养的菌转接入120ml的液体培养基中相同条件下培养12h，4℃下保存备用。

2、嗜水气单胞菌染色体DNA的提取：

移液枪取一嗜水气单胞菌菌落,接种于营养肉汤,于28℃培养18～24h。

3、引物的设计：

基于A.hy drophila的Aer基因序列及其相似性比对,设计了4条特异性引物,即F3、B3、FIP和BIP,其序列依次为:

F3:5′-CGGTAAAGCCCTGGACTCT-3′；

B3:5′-CCGCCTTTGTGTCATATCGA-3′；

FIP:5′-GATCAGGATGCCGACACCGAC-GCCCAGTCAGACGTCACT-3′；

BIP:5′-ATGTCTTTGCTCATCGGGACGC-AACGATGCCCTGTAGCCTT-3′。

4、提模板：

取1ml1.2.2培养液于离心管中，12000r/min离心5min。去掉上清液然后加入100ul无菌水混合，100℃水浴加热10min，冰浴2min，12000r/min离心5min，保留上清液备用。

5、LAMP反应体系的建立

(1)、温度实验

取5个PCR管，分别标号1～5。在这五个管中，分别加入表2所示试剂。接着在T100^TMThermal Cycler上分别设置温度为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，时间均为90min扩增。扩增完后在电泳仪上电泳，最后在凝胶成像分析仪上得到结果。

表2 LAMP反应体系