[发明专利]乳中游离多肽的测定方法

说明书

本发明公开了一种乳中游离多肽的测定方法，其包括以下步骤：将样品乳进行脱脂和蛋白质脱除处理之后，取上清液；将上清液选用截留分子量为5‑30KDa的滤管离心，于4℃，6000g条件下离心10‑20min，得滤过液；对所述滤过液进行脱盐处理制得多肽样品，将所述多肽样品进行质谱测定。本发明所述乳中游离多肽的测定方法，前处理步骤简单，容易操作，通过质谱测定出的游离多肽种类多，测定结果精确，为乳品鉴定以及乳源体质鉴定提供可靠的理论依据。

技术领域

本发明涉及一种乳品分析方法。更具体地说，本发明涉及一种乳中游离多肽的测定方法。

背景技术

众所周知，乳中含有丰富的蛋白质，是蛋白质的优质来源之一。可是，对乳中同样由氨基酸组成的多肽关注较少。对生物学样本中多肽的研究称之为多肽组学。在医学领域，血清中多肽组学的研究对于疾病的诊断具有重要的意义，现在已有技术利用血清中特有肽段的种类及含量进行肿瘤的诊断。另外，有研究显示人体呼吸系统、心血管系统及神经系统中游离肽段具有重要的生物学功能。

可是，目前对于乳中多肽组学的研究相对较少。因为乳是一种独特的生物学体系，其中脂肪、蛋白及盐类的组成与人体血清组织有所不同，进而适用于其他人体组织中的多肽组学技术并不完全适用于乳品研究。因此，根据乳品体系的特点，开发适用于乳中多肽的方便、准确及深入的组学方法对深入挖掘乳品多肽的功能性质，开展乳中生物学标记物研究具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种乳中游离多肽的测定方法，其样品乳的前处理操作简单，所述超滤步骤彻底除去影响质谱测定的蛋白质，质谱测定鉴定出的乳中多肽数量大，范围广，来源广泛。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种乳中游离多肽的测定方法，其包括以下步骤：将样品乳进行脱脂和蛋白质脱除处理之后，取上清液；将上清液选用截留分子量为5-30KDa的滤管离心，于4℃，6000g条件下离心10-20min，得滤过液；对所述滤过液进行脱盐处理制得多肽样品，将所述多肽样品进行质谱测定。

优选的是，所述脱脂具体包括：将样品乳在4℃条件下，于7000-9000rmp转速下离心10-20min脱除乳中脂肪。

优选的是，所述蛋白质脱除具体包括以下步骤：

(1)乙醇沉淀蛋白质：将经过脱脂的样品乳置于冰盒中,在低温条件下加入纯乙醇抽提,边加边搅拌,使乙醇终浓度为60％(V/V),搅拌25-35min后,12000g离心8-10min,取上层清亮液体；

(2)乙醇脱除：将所述上层清亮液体进行真空浓缩至接近干燥；然后加水至1ml，于4℃，8000rpm条件下离心5min,去沉淀,留取上清液。

优选的是，所述脱盐处理具体为：利用SPE C18柱对所述滤过液进行脱盐处理。

优选的是，所述质谱测定具体包括：多肽样品利用Ultimate 3000-液相-Q-Exactive HF二级质谱进行测定；质谱条件为：流动相为5-35％乙腈，流速为600nl/min.荷质比为300-1400的离子被Orbitrap收集。

优选的是，所述多肽样品选用360um*2cm的c18搜集柱及150um*12cm的分离柱进行分离。