[发明专利]树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K、生产及其介导质粒DNA转染的方法

权利要求书

1.一种树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列为：

2.根据权利要求1所述的树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，能把与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。

3.根据权利要求1中所述树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K，其特征在于,所述穿膜肽在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。

4.根据权利要求3所述树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述标记物选自由荧光素、生物素、亲和基团所组成的组。

5.根据权利要求3所述细胞穿膜肽hPP7K，其特征在于，所述货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子或纳米微球所组成的组。

6.一种权利要求1所述树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；

(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量二甲基甲酰胺(DMF)，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；

(3)称取相当于树脂1～10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1～10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂或苯并三唑鎓盐型缩合剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；

(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；

(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；

(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys2-Lys)2-Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；

(8)将干燥后的肽-树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；

(9)运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化后，得到所需多肽链hPP7K。

7.根据权利要求1所述树枝状人源性细胞穿膜肽hPP7K介导质粒DNA转染方法，其特征在于，包括以下步骤：

(i)将质粒pEGFP或PdsRED与所述穿膜肽hPP7K分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；

(ii)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比,调整两者间N/P比；

(iii)养过夜的细胞，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒DNA和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；

(iv)6小时后去掉培养基加含有10％FCS的新鲜培养基；

(v)静置1-4小时。