[发明专利]无成瘤性MDCK细胞克隆株

说明书

技术领域

本发明涉及一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。

背景技术

MDCK细胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK）由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的适于流感病毒复制的3种细胞系之一。

流感(Influenza) ，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发。禽流感（Bird Flu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，通常人感染禽流感死亡率约为33%。目前为止无论是流感还是禽流感未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疾病发生和流行最有效的手段。

我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。若采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。另外，贴壁型的传代细胞可用生物反应器微载体规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖自动控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病毒的工艺和转瓶培养传代细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势。

目前国际上已有几家企业已批准利用MDCK细胞生产流感疫苗。荷兰苏威制药公司（Solvay Pharmaceuticals）生产的流感病毒裂解疫苗Influvac®TC于2001年在荷兰获得批准。诺华公司（Novartis Vaccines）经过驯化获得的MDCK细胞株生产的Optaflu®于2007年获得了欧洲药品审评署（EMEA）的批准，Optaflu®在欧盟27个成员国、冰岛和挪威得到了广泛的使用。Optaflu®的上市标志着近50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。Flucelvax®灭活疫苗（甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒）于2012年11月获得美国FDA批准用于18岁以上成人流感预防接种。阿斯利康(AstraZeneca)旗下的MedImmune公司生产的4价减毒活疫苗Flumist®于2010年获得美国FDA的批准用于2-45岁人群接种。

MDCK细胞用于流感疫苗生产的主要争议是因为其具有成瘤性。2005年11月16日疫苗和相关生物制品顾问委员会（VRBPAC）组织召开的会议讨论了MDCK细胞作为细胞基质用于流感疫苗生产的相关事宜，并且着重讨论了MDCK细胞的成瘤性问题。会议期间诺华公司、荷兰苏威制药公司、美国医学免疫学公司分别做了MDCK细胞的研究报告。诺华公司的研究报告显示无血清悬浮培养型MDCK细胞的成瘤性非常强，10个细胞就可以对裸鼠成瘤，但是对该公司通过驯化获得的MDCK细胞株33016-PF的研究显示该细胞株对裸鼠不成瘤。荷兰苏威制药公司的研究报告显示MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P56）接种的细胞量高于10⁷细胞对裸鼠成瘤，建立的细胞库细胞传代至P98代时接种10⁵细胞量就对裸鼠形成肿瘤。美国医学免疫学公司生产流感疫苗使用的细胞是该公司自主研发获得的无成瘤性MDCK贴壁细胞株，接种10⁷细胞量对裸鼠不成瘤。目前，获得无成瘤性MDCK细胞株仍是各国科研人员研究的重点。

发明内容

本发明提供了一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。本发明对ATCC引进的MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P56）通过单细胞克隆、染色体分析和裸鼠接种筛选得到了无成瘤性的MDCK细胞克隆株，并在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行了保藏，保藏编号为：C2016151，分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

本发明的第一个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株，所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK-C65，保藏编号为：C2016151。

本发明的第二个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株在流感疫苗生产中的应用。

作为优选，所述MDCK细胞克隆株作为细胞基质用于流感疫苗生产。