[发明专利]用重组大麦条斑花叶病毒载体介导的小麦靶标miRNA过表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦内源靶标miRNA过量表达的方法，利用该方法能够研究小麦内源miRNA在小麦生长发育或响应逆境中的生物学作用。

背景技术

近年来，大量研究发现在生物体内存在的miRNA是一类内源的长度为18-24个核苷酸的小的非编码RNA，它是由生物体内源基因转录加工而成的具有茎环结构的长的单链RNA前体(pre-miRNA)产生的(Chen 2009；Bartel2004)。植物内源miRNA能与其序列互补的mRNA结合，通过序列切割或抑制序列翻译的方式抑制靶标mRNA表达，是强有力的转录后调节子；参与调控植物的生长和发育以及植物对生物逆境和非生物逆境的响应(Chen 2004；Sunkar et al.2006；Xue et al.2009；Xin et al.2010；Kantar et al.2011；Wang et al.2011)。植物中的第1个miRNA是在拟南芥中被发现的(Llave et al.,2002)；至今，在miRNA公共数据库(miRBase，Release 21.0,June,2014；http://www.mirbase.org)中注册的miRNA有从约73种植物中鉴定出的大约8496个miRNA。然而，这些miRNA中生物学功能已研究清楚的miRNA数目非常有限；而且其中大多数是来自模式植物拟南芥、水稻和西红柿(Schommer et al.,2012；Zhang et al.,2013)。在模式植物拟南芥和水稻中建立了2种反向遗传学策略用于特定miRNA的功能研究。一种策略是转基因过表达加强特定miRNA活性(Allen et al.,2007；Zhang et al.,2013)；另一种方法是通过特定miRNA基因突变(Baker et al.,2005)或表达抗特定miRNA的靶标(即靶标基因的沉默突变)(Zhao et al.,2007)、特定miRNA仿靶标(MTM)(Franco-Zorrilla et al.,2007)、或短的串联仿靶标(STTM)(Yan et al.,2012)以阻断特定miRNA活性。而这些策略都依赖于植物转基因和稳定的转基因植株产生，因而限制了其在遗传转化频率低的物种或高通量分析中的应用。世界上最重要的粮食作物之一—异源六倍体普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD；2n＝6×＝42)具有庞大而复杂的基因组，加之，其遗传转化率很低；构建突变体库需要转化子的数目非常庞大，在模式植物中建立的miRNA功能研究策略无法应用于重要粮食作物小麦。目前，在小麦中尚缺乏用于miRNA功能研究的切实可行的有效方法。

近年来，建立和发展的病毒诱导的内源靶基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)方法可以通过在一些植物中瞬时创建蛋白编码基因抑制的表型，已逐渐成为蛋白编码基因功能鉴定的有效工具。迄今，适用于粮食作物小麦VIGS的病毒载体仅有大麦条斑花叶病毒(the Barley stripe mosaic virus，BSMV)载体，它由α、β、γ3条RNA正链组成；经过改造的重组BSMV载体已被用于小麦蛋白编码基因的沉默及功能鉴定(Scofield et al.,2005；Ma et al.2012)。但迄今，尚没有关于小麦内源小的非编码miRNA的过量表达技术方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦内源靶标miRNA过量表达的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案予以实现：

第一种技术方案：

一种用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，其特征在于，将携带小麦PDS基因的人工miRNA(ami-PDS)前体片段的重组BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦；接种部位为小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或小麦扬花期穗部，接种方法为用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后观察因ami-PDS过量表达而导致PDS基因表达被抑制的光漂白或退绿表型。

第二种技术方案：