[发明专利]一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株MG A7，保藏编号为CCTCC NO:C201666。本发明以羧基隐性孔雀石绿与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌IgM k链单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于孔雀石绿的快速、准确免疫检测和免疫分析。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

孔雀石绿(MalachiteGreen oxalate，MG)是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、细菌及寄生虫的药物。由于这类药物高效、价格低廉，所以多年来被广泛应用于水产养殖领域，用于预防和治疗疾病。

研究发现，孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢为脂溶性的隐性孔雀石绿(LMG)，隐形孔雀石绿由于其特性，能长期积蓄在机体组织内，残留毒性强；在哺乳动物体内，孔雀石绿会引起细胞转化和脂质过氧化，进而威胁人体健康，引发肿瘤。鉴于孔雀石绿具有潜在的致癌、致畸、致突变等危害性，《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中明确规定禁止将孔雀石绿应用于所有食品及动物。依据评估结论，MG和LMG的最高残留限量为“不得检出”。但由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用一直屡禁不止。

目前，对于孔雀石绿残留的检测方法主要以理化检测法和免疫学方法为主。其中理化检测法包括：薄层层析法、高效液相色谱法、拉曼光谱法、液质联用法等。这些方法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长，且不能用于现场检测，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入制度实施对检测方法时效性的需求。利用抗体与抗原的反应为核心发展起来的免疫学检测方法主要有：酶联吸附免疫法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)等，这些方法具有高通量检测和操作简便、快速等优点，因而尤其适合在基层单位的应用和现场快速检测。

开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果假阳性、假阴性率偏高，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。

发明内容

本发明提供了一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗孔雀石绿单克隆抗体。

一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株MG A7，已于2016年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201666；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。

本发明提供了一种制备所述杂交瘤细胞株的方法，包括：

(1)将牛血清白蛋白和羧基隐性孔雀石绿混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞；

(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；

所述羧基隐性孔雀石绿与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～50:1；所述偶联物的偶联比为2～5:1。

作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。