[发明专利]一种用于NKT细胞培养的融合蛋白、编码基因及应用

权利要求书

1.一种用于NKT细胞培养的融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与用于NKT细胞培养的由a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下与序列1限定的DNA片段杂交且编码与用于NKT细胞培养相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与用于NKT细胞培养相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述重组表达载体在NKT细胞培养中的应用。

6.一种人NKT细胞的体外制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S100、包被细胞培养瓶：用杜氏磷酸盐缓冲液配制包被液，所述包被液包括CD3单克隆抗体1-10μg/ml、如权利要求1中所述的融合蛋白5-25μg/ml；将所述包被液加入培养瓶中避光放置8-24h；

S200、单个核细胞的制备：抽取人体外周血，使用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，使用含有自体血浆、人CD3单克隆抗体的淋巴培养液重悬细胞得到细胞悬液；

S300、NKT细胞的诱导扩增：移除包被液，加入所述细胞悬液至细胞培养瓶后，添加细胞因子形成持续的刺激，置于CO₂饱和湿度培养箱中培养获得NKT细胞。

7.根据权利要求6所述的人NKT细胞的体外制备方法，其特征在于，所述步骤S100中，所述包被液中所述融合蛋白的浓度为10-15μg/ml、所述人CD3单克隆抗体的浓度为4-7μg/ml；取包被液10ml，加入到75cm²培养瓶中，4℃避光放置过夜，备用。

8.根据权利要求6所述的人NKT细胞的体外制备方法，其特征在于，所述步骤S200中，所述单个核细胞用DPBS清洗两次，显微镜下观察计数，使用含5％自体血浆、50ng/ml人CD3单克隆抗体的淋巴细胞培养液GT-T551重悬细胞，调节细胞密度3×10⁶个/ml。

9.根据权利要求6所述的人NKT细胞的体外制备方法，其特征在于，所述步骤S300包括如下步骤：

S301、移除包被液，用10ml DPBS轻轻漂洗一次，再用10ml GT-T551轻轻漂洗一次；

S302、加入所述细胞悬液至该培养瓶，然后加入重组人干扰素-γ至终浓度为500-1000IU/ml，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24h；

S303、分别加入重组人白介素-2至终浓度为500-1000IU/ml、重组人白介素12至终浓度5-50ng/ml、白介素15至终浓度5-50ng/ml；之后每3天向该细胞培养瓶中补加细胞培养液，补加的细胞培养液为含有0.5％自体血浆、50ng/ml的人CD3单克隆抗体、1000IU/ml重组人白介素-2、10ng/ml重组人白介素12、10ng/ml重组人白介素15的GT-T551培养基。

10.根据权利要求9所述的人NKT细胞的体外制备方法，其特征在于，所述步骤S303中，分别加入重组人白介素-2至终浓度为1000IU/ml、重组人白介素12至终浓度10ng/ml、白介素15至终浓度10ng/ml。