[发明专利]一种玉米赤霉烯酮适配体亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。

背景技术

玉米赤霉烯酮( zearalenone, ZEN) 又称F-2 毒素, 是一种2, 4-二羟基苯甲酸内酯类化合物, 具雌激素活性, 化学名称为6-( 10-羟基-6-氧基碳烯基)-β雷锁酸-μ-内酯。是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的真菌毒素。它广泛存在于自然界, 对动物的生长发育有着重要的作用,具有很强的雌性激素作用,可引起猪、大鼠、小鼠、家禽等多种动物和人的雌激素过多综合征, 还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。主要污染玉米、小麦、大麦等粮谷类作物,。Plcinta 对世界上近二十个国家的谷物和动物饲料中的真菌毒素含量做了一个调查, 发现大多数国家的谷物和动物饲料中都不同程度地受到ZEN 的污染并导致家禽的毒害, 我国的江苏、四川、河北、上海郊区等地也发生过因ZEN 导致猪中毒的事件。为了控制ZEN 对人和动物产生的危害,至2003 年,世界上已有19 个国家制订了食品中ZEN 限量标准,而且欧盟于2005 年制定了食品中ZEN 统一限量标准。例如澳大利亚规定谷物中ZEN 的含量不能超过50ng/g,意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN 的含量不能超过100ng/g, 而在法国, 植物油和谷类当中ZEN 的含量必须低于200ng/g 。目前,中国尚未建立食品中ZEN 的国家标准检测方法, 为保护中国在世界粮食贸易中的经济利益和消费者健康,迫切需要建立测定ZEN 的国家标准检测方法,并制订其限量标准。

目前玉米赤霉烯酮的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、酶联免疫分析法等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测玉米赤霉烯酮的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低,无需价格昂贵的仪器,。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,主观影响较大,灵敏度不高等,已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验（EL ISA ）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用,因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来,从而使样品中的毒素得以净化。Angelo 等[J Chromatogra2phy A ,1998 ,815 :133～140.9 ]用乙腈2水(90 ∶10) 提取玉米样品,用VicamZEN 免疫亲和柱进行纯化,并用反相HPLC 检测。在0. 1～10 μg/ g 的加标水平的回收率为93 %～99. 5 %,相对标准偏差为6 % ,检出限为3 ng/ g ,信噪比3 ∶1 。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。 单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。