[发明专利]焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

糖尿病是我国及全球面临的最严重、最危急的健康问题之一。糖尿病患病人数逐年递增，并产生影响终生的并发症。据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2015年全球约4.15亿糖尿病患者，占世界人口比例的8.8％，另有3.18亿成年人处于糖耐量受损状态，而糖耐量受损是未来糖尿病发生的高危因素。中国人群糖尿病患病率为9.8％，患病人数约1.10亿，未诊断糖尿病患者约0.57亿，高居世界首位。值得关注的是，糖尿病导致的并发症是致残、降低生活质量和导致早亡的主要原因。2015年我国死于糖尿病患者高达129.97万人，用于糖尿病及其并发症的医疗费用占总医疗费用的13％，其中糖尿病血管并发症是致死及高额医疗支出的首要原因。

Tribbles pseudo-kinase 3(TRIB3)是一个假激酶，能与Akt结合并抑制胰岛素介导的Akt磷酸化激活诱导葡萄糖稳态水平的损伤。临床研究表明TRIB3过度激活或TRIB3(rs2295490,A>G)基因突变与2型糖尿病患者胰岛耐受及其心血管并发症风险增加显著相关。动物实验研究表明缬沙坦(降压药物)能够显著下调糖尿病心肌肥厚小鼠TRIB3mRNA水平及改善心肌功能。体外研究表明TRIB3(rs2295490,A>G)基因多态性不影响胰岛素介导IR，TIS.1的激活，也不影响TRIB3蛋白水平，但影响Akt(Thr308,Ser473)和eNOS(Ser1177)磷酸激活，进而导致胰岛素刺激HUVEC细胞一氧化氮生成降低3倍左右。

近期，我们的大样本5年随访临床研究表明，TRIB3(rs2295490,A>G)G等位基因频率为17.1％。对年龄大于55岁，接受标准糖化血糖控制(遵医嘱治疗，HbA1c约为7.3％)的2型糖尿病患者，AG/GG基因型携带者主要大血管及微血管事件患病风险显著增加。相反，接受强化血糖控制(HbA1c≤6.5％)的2型糖尿病患者，主要大血管及微血管事件患病风险显著降低(Intensive vs Standard*AG/GG:HR＝0.58(0.42–0.79),P＝0.001)。而对AA基因携带者，强化血糖控制并无显著心血管疾病获益(Intensive vs Standard*AA:HR＝1.04(0.83-1.31),P＝0.72)。提示对该突变位点检测对2型糖尿病个体化治疗方案制定，心血管疾病获益预测及降低低血糖事件发生具有重要临床意义。

综上所述，TRIB3基因多态性与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TRIB3基因多态性的试剂盒将为2型糖尿病个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

TRIB3基因多态性是与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关。本发明提供一种检测2型糖尿病易感基因TRIB3基因多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测TRIB3基因多态性。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒包括如下引物：

(1)扩增引物：

TRIB3(rs2295490)上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′(SEQ ID NO.1)；

TRIB3(rs2295490)下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′(SEQ ID NO.2)；其中，下游引物的5'-进行生物素标记；

(2)测序引物：

TRIB3(rs2295490)测序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′(SEQ ID NO.3)；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

所述应用上述试剂盒检测TRIB3基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：