[发明专利]一组用于头颈鳞状细胞癌淋巴结转移速检的LAMP引物组CK19-146

说明书

本发明筛选出用于快速检测HNSCC淋巴结转移的特异性标志物基因及其基因组合，即CK7、CK19、CK7+CK19；建立了HNSCC患者淋巴结快速检测技术体系，即应用RT‑LAMP法进行淋巴结状态检测；可将整个实验过程控制在四十分钟左右。本发明所述检测方法耗费时间短，实验温度低、结果准确性高且判读方式简便。以RT‑LAMP技术为基础建立的HNSCC淋巴结快速诊断体系，使此类患者术中快速判定其淋巴结转移状态成为可能。

技术领域

本发明属于生命科学与临床医学领域。更具体的，本发明涉及用于头颈鳞状细胞癌淋巴结转移速检的LAMP引物组，以及头颈鳞状细胞癌淋巴结转移的临床、尤其是术中快速检测方法。

背景技术

头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)在全球癌症发病率中排第六位，全世界每年有近65万新增病例，近年来恶性肿瘤诊治手段日新月异，然而HNSCC的5年生存率并没有明显提高。HNSCC治疗方案的选择及预后判断主要取决于TNM分期以及组织学分级，其中颈淋巴结转移情况对预后的影响较大。临床上约47％的HNSCC患者就诊时已经伴有颈淋巴结转移。因此颈淋巴结转移的准确检测对于HNSCC选择合理的治疗方案以及个体预后至关重要。

目前国内外颈淋巴结的转移状态主要依赖于局部触诊、影像学检查、病理检查等临床诊断手段。尽管随着超声、CT、MRI、PET、超声引导细针穿刺细胞学检查、术中冰冻切片病理检查等诊断技术的不断发展，颈淋巴结转移在术前术中诊断方面已有了一定进步，但迄今为止尚没有一种方法的诊断正确率能够完全满足临床需要，对于直径小于2mm的微转移灶更是无法准确检测。由于术前术中诊断手段较为局限，目前有10％～20％术前临床诊断为颈淋巴结转移阳性(clinical N+,cN+)的患者，术后病理检查未发现淋巴结转移，而同时约有25％术前临床诊断为颈淋巴结转移阴性(clinical N0,cN0)的患者术后病理却为淋巴结转移阳性。对于这1/4的cN0患者如果进行随访观察，患者将面临治疗不充分而带来的巨大风险；而对于另3/4的cN0患者和前述部分cN+患者，额外的治疗则完全没有必要，过度治疗带给患者的只有治疗风险和生活质量下降。

现已有研究开始探索分子生物学检测技术，即通过逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)检测上皮来源特异mRNA的表达来判断淋巴结的转移状态。但常规的qRT-PCR分析一般需要3-4个小时的时间，不利于术中进行，因此临床特别需要一种能够准确、快速检测颈淋巴结状态的分子生物学方法。

发明内容

为解决上述技术问题，填补现有技术空白，本发明在初步筛选出与HNSCC颈淋巴结转移相关的特异性分子标志物的基础上，建立了头颈部鳞状细胞癌颈淋巴结转移术中快速检测方法，即应用RT-LAMP检测方法进行检测，在手术过程之中即可判断淋巴结的转移状态，指导术中治疗，确立有效、快速、低廉的检测方法；不仅为肿瘤诊断的研究提供新的依据，而且能够有效减少患者的痛苦，提高患者的预后，也可以大幅节省患者和医院的开支，具有非常重要的临床和社会意义。

本发明具体技术方案如下：

1、收集手术切除的新鲜标本：组织标本切取后，向临床医师确定肿瘤部位、范围及肉眼可以判别的浸润情况，并进行描述和详细的临床记录。

2、筛选HNSCC淋巴结转移特异性标志物基因：通过文献报道和检索数据库确定检测HNSCC淋巴结转移的可能mRNA标志物。检索来源包括：PubMed、OMIM、UniGene、GeneCards、CGAP。共预选出39个候选基因。使用qRT-PCR实验对上述候选基因进行2轮筛选：

1)第一次基因筛选：选择原发HNSCC患者19例肿瘤组织和非癌患者的15例良性淋巴结组织，非癌患者的诊断分别为：11例诊断结节性甲状腺肿、2例诊断颈动脉体瘤、1例诊断先天性甲状舌管囊肿、1例诊断头颈部皮下囊肿。应用qRT-PCR法分析上述39个候选基因，选取明确差异表达的4个基因(CK7、CK19、EGFR、TACSTD1)用于后续研究；