[发明专利]基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

宫颈癌是最为常见的妇科恶性肿瘤之一，是危害女性健康与生命的主要疾病。流行病学调查显示，每年全球有46.5万宫颈癌新发病例，其中中国每年约有13万新发病例。目前宫颈癌的发病年龄趋于年轻化，受宫颈癌侵害的女性多处于生儿育女及经营家庭的黄金时期。

宫颈癌不同于其他肿瘤，疾病自然史明确，有一系列的癌前病变，它的发生和发展是由量变到质变、渐变到突变，要经历几年到十几年的过程。因此，宫颈癌的防治关键在于通过筛查及时发现和治疗宫颈病变，终止其向宫颈癌的发展。因而，早发现、早诊断及早治疗对于提高宫颈癌治疗效果具有重大意义。

目前采用的宫颈癌常规筛查技术包括：

巴氏涂片法：该技术灵敏度低，特异性一般，检测方法人为干扰因素较大，结果准确性有限及成本低；

液基薄层细胞学检测(Thin-Cytologic Test，TCT)：该技术灵敏度低，特异性高，检测方法需要人工观察分析且易干扰，对非典型鳞状细胞诊断率不高，无法检查宫颈腺癌；

HPV-DNA检测：该技术灵敏度高，特异性低，检测方法通量高，适用于大规模临床筛查，但是假阳性率高，只能预警而非早期发现；

HPV-E6E7mRNA检测：该技术灵敏度高，特异性一般，检测方法分型体系复杂，RNA不稳定，检测的是病毒而非个体基因，也只能预警而非早期发现。

上述这些方法均存在操作繁琐、假阳性率高、灵敏度低等缺点，限制了其在临床实验室的准确筛查。

近期宫颈癌DNA甲基化研究表明，PAX1的DNA甲基化改变与宫颈癌的病情进展相关联。PAX1基因在宫颈癌变的发生机制中起到潜在的抑癌作用，PAX1基因的高甲基化可以促进宫颈癌的发生。因此检测宫颈癌PAX1基因启动子的甲基化状态，对宫颈癌的筛查具有重要的意义。

目前，传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。

因此，有必要提供一种新的宫颈癌PAX1基因的甲基化检测方法来克服上述缺陷。

发明内容

为了解决上述传统甲基化检测方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的技术问题，本发明提供一种操作简单、准确性高及敏感性高且基于荧光PCR技术的基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对、试剂盒及其方法。

本发明提供了一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的引物对，包括针对PAX1基因和ACTB基因的启动子区的特异性引物及探针，如下：

PAX1正向引物：5'-GTGGAGAGTGTTTTGGGAGGG-3'(SEQ ID NO.1)，

PAX1反向引物：5'-CTACCRCCCRCTCCAAAACC-3'(SEQ ID NO.2)，

PAX1检测探针：5'FAM-TAGTAGCGGCGGCGGT-3'MGB(SEQ ID NO.3)；

ACTB正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQ ID NO.4)，

ACTB反向引物：5'-ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC-3'(SEQ ID NO.5)，

ACTB检测探针：5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供了一种基于宫颈癌特异性甲基化检测的试剂盒，包括含有如上述引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：PAX1正向引物、PAX1反向引物、PAX1检测探针，ACTB正向引物、ACTB反向引物、ACTB检测探针，10×PCR buffer，dNTP及无核酸酶水。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括Ex Taq酶。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCR buffer，0.4μM PAX1正向引物、0.4μM PAX1反向引物、0.4μM PAX1检测探针，0.4μM ACTB正向引物、0.4μM ACTB反向引物、0.4μM ACTB检测探针，0.25mM dNTP。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品及阴性对照品，所述阳性对照品为甲基化标准品DNA，所述阴性对照品为非甲基化标准品DNA。