[发明专利]生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法

说明书

本发明公开了一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，可以快速鉴定食品、化妆品和饲料中未知动物源性成分，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于二代测序技术的通用型物种特异性DNA分析技术，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用方法。

背景技术

动物源性制品的掺假是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，饲料和食品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等问题。一方面由于不同物种来源的动物组织、皮革、血液等本身具有相似的物理形态以及工业化处理加工技术的影响，普通消费者自己很难准确判定物种来源特别是众多混合动物源性制品各组成部分的真实性。未知来源的动物源性成分存在巨大的经济和安全漏洞，这是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，动物源性制品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等多方面问题。另一方面国内外目前使用的所有检测技术均不具备对未知来源的动物源性成分进行准确鉴定的能力。因此建立全新的通用型检测方法来对食品和饲料中的动物源性成分进行鉴定的研究显得十分必要和重要。

目前在食品安全检测技术方面，基于DNA序列的检测方法如聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光PCR技术(Real-time fluorescencepolymerase chain reaction，qPCR)相比于其他方法具有较高的特异性、灵敏度和稳定性等优点，是目前最重要的检测技术，在食品饲料中转基因成分检测、动物源性成分检测、病原微生物检测、过敏源检测、真假鉴别等方面均具有非常成功和广泛的应用。但这些基于PCR技术的检测方法均具有一个严重的技术瓶颈，只能针对某一物种设计具有针对性的引物，然后针对其进行有目的的检测，如果待测样品是混合样品并具有完全未知的物种，则这些方法均无法完成检测。这一技术瓶颈一直困扰着相关领域检测工作人员。因此，有必要建立一种特异性好、且在一次实验中对混合样品中各已知或未知动物源性成分进行准确定性检测的检测方法。

DNA条形码技术是使用一段两端相对保守、中间具有足够区分度的，易于扩增的较短的DNA片段，并利用其具有种间特异性和种内保守性而创建的一种新的生物身份识别系统，以实现对物种的快速鉴定。

第二代测序技术(Next-generation sequencing)利用接头技术进行高通量并行PCR以实现大规模平行测序，同时结合微流体技术，利用计算机对测序数据进行拼接和分析，而且DNA被测次数还可以间接反映某种DNA的相对丰度。

发明内容

针对现有生物监测技术无法全面甄别不确定动物源性成分的不足，本发明的目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于高通量测序技术和DNA条形码分析技术的通用型动物源性成分检测方法，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用策略。该方法可以实现对复杂混合生物制品中不可预测或未知物种进行准确筛选和鉴定，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，该通用型检测方法包括以下步骤：