[发明专利]一种浙江楠体细胞胚诱导方法

说明书

本发明公开了一种浙江楠体细胞胚诱导方法，其包括如下步骤：1)以浙江楠未成熟果实为外植体，进行表面灭菌；2)剥取种子幼胚，接种于体细胞胚诱导培养基上，进行体细胞胚诱导；3)将步骤2)诱导体细胞胚接种于体细胞胚增殖培养基上，进行体细胞胚的增殖，产生次生胚。本发明首次建立了浙江楠未成熟合子胚的体细胞胚直接发生方法，处于球形胚或向心形胚转换时的合子胚在本发明的培养基上，体胚发生率可达65％。在最佳增殖培养基，增殖系数可达14.3，在最佳体胚萌发培养基，体细胞胚的萌发率可达68.5％。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种浙江楠体细胞胚诱导方法。

背景技术

浙江楠(Phoebe chekiangensis)属樟科楠属的高大乔木,是“金丝楠木”的原种植物种之一,具有很高的经济价值，为亚热带东部区特有珍贵树种，自然分布于浙江、福建北部、江西东北部和安徽南部(中国科学院中国植物志编辑委员会，1982；安徽植物志协作组,1986)。树干通直，材质优美，是高档家具制作的特用材；树体高大，四季翠绿，也是园林绿化优良树种。虽然浙江楠经济与观赏价值特高，但现存资源极少,保护和扩繁优异种质资源成为该种研究的热点与重点。之前的研究多集中于种子休眠(史晓华和史忠礼,1990)、苗木培育(李冬林和向其柏,2004,2006；王艺等,2013)、人工林栽培(彭龙福,2003；吴载嶂,2005)和生态学(马明东等,2008；王琦等,2013)等方面，而利用现代生物技术对其进行体细胞胚的诱导等快繁未见研究报道。

浙江楠主要行种子繁殖，但因其大树资源极少、结实不稳定，种子量少，导致其种苗的供应严重不足。同时，实生苗后代分离严重，不能固定优异母本的优良性状。可见，亟需用现代生物技术进行无性方式扩繁优良基因型，以此保育、繁育浙江楠优异种质。一般无性繁殖主要通过扦插和组织培养两方面来实现。但浙江楠至今扦插繁殖成活率低，且受扦插用穗条材料和季节限制，大树因生理年龄大而不能成活，无法实现规模化繁育应用。组织培养具有繁殖速度快、能保持母本的优良遗传特性等优点，是实现种质大量繁殖、长期保存的重要可选择途径，尤其是采用体细胞胚性愈伤，诱导体细胞胚发生，以实现体胚快繁浙江楠优质种苗。同时，实现体胚培养对于优异种质资源保存以及进一步的基因转化技术、优良杂交组合扩繁等均具有重要意义。因此，构建完善的体细胞胚胎发生体系，提高人工繁殖效率是保证具有优良性状浙江楠能稳定遗传并扩大繁殖满足种质保育与林业生产需求的重要途径。

目前落叶松、云杉、杉木等树种已有较好的体胚发生体系，但不同类树种具有特异的体胚发生技术，尤其是濒危树种会有更高的技术要求。针对濒危树种浙江楠，采用从不同发育阶段的未成熟胚采集入手，寻找特殊的诱导培养的时间，筛选最适体胚发生培养基及其培养条件，创出完善的浙江楠体细胞胚胎发生体系。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种浙江楠体细胞胚诱导方法。

首先，本发明提供一种浙江楠体细胞胚诱导培养基组，其包括体细胞胚诱导培养基、体细胞胚增殖培养基和体细胞胚萌发培养基，所述的体细胞胚诱导培养基为含有下述成分的MS固体培养基：谷氨酰胺400-600mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、2,4-D 0.4-0.6mg/L、6-BA0.8-1.2mg/L，所述的体细胞胚增殖培养基为含有下述成分的MS固体培养基：6-BA0.1-1.0mg/L、NAA 0.1-1.0mg/L，所述的体细胞胚萌发培养基为含有下述成分的MS固体培养基：6-BA 1.0mg/L、IBA 0.1mg/L或者NAA0.1mg/L。

其中，所述的体细胞胚诱导培养基为含有下述成分的MS固体培养基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D 0.5mg/L、6-BA1.0mg/L，所述的体细胞胚增殖培养基为含有下述成分的MS固体培养基：NAA 0.1-1.0mg/L，所述的体细胞胚萌发培养基为含有下述成分的MS固体培养基：6-BA 1.0mg/L、IBA 0.1mg/L。

本发明还提供一种浙江楠体细胞胚诱导方法，其包括如下步骤：