[发明专利]一种提高MTSase和MTHase产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高MTSase和MTHase产量的方法，属于发酵工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种常见的天然糖类，具有独特的理化性质和生物功能，对生物分子具有特殊的保护作用。目前海藻糖的制备方法包括天然生物提取法、微生物发酵法、化学合成法、基因工程法和酶转化合成法。其中，酶法制备海藻糖研究的最多，应用的也最广泛。

生物体内存在着不同的海藻糖合成途径及其相关的酶系，可以通过提取生物体内的酶系或将这些酶系的基因进行异源克隆表达，并利用这些酶系催化底物生成海藻糖，实现海藻糖的大规模制备。酶法制备海藻糖的方法通常包括磷酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法三种方法。

双酶法是由麦芽糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase)共同作用于直链淀粉或麦芽糊精生成海藻糖，反应产物主要为海藻糖，以及少量副产物(如葡萄糖、麦芽糖等)。其以淀粉为原料，生产成本低，且副产物少，易于产物的分离纯化，适合工业化生产。但是在实际应用过程中，两种酶的分别发酵就需要投入双倍的生产资源，大大的增加了生产成本。因此寻求一种节约生产成本的方法就成了双酶法应用中需解决的问题。关于MTSase和MTHase的来源，目前已报道的文献中，主要包括嗜热硫矿硫化叶菌，芝田硫化叶菌，嗜酸热硫矿硫化叶菌，分支节杆菌，微黄短杆菌，根瘤菌，谷氨酸棒状杆菌等。从耐热古菌芝田硫化叶菌、嗜酸热硫化叶菌中克隆了treY、treZ用大肠杆菌来表达，获得了具有相应酶活的蛋白，但活性不高，部分蛋白以不溶性包涵体形式存在；用pTrc99a做表达载体，在E.coli BL21(DE3)中异源表达出sulfolobus solfataricus来源的MTSase和MTHase，活性分别为31.3U/g(wet cell)和400U/g(wet cell)。以E.coli BL21(DE3)为宿主表达谷氨酸棒杆菌来源的MTSase，其发酵液酶活力为45.09U/ml。现有报道的MTSase或MTHase的生产菌株酶活难以满足工业化需求，因此，为了尽快推进海藻糖的工业化生产，急需高MTSase和MTHase酶活及产量。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种产MTSase和/或MTHase的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达来源于Arthrobacter ramosus的编码麦芽糖基海藻糖合成酶和/或麦芽糖基海藻糖水解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因来源于Arthrobacter ramosus S34。

在本发明的一种实施方式中，所述编码麦芽糖基海藻糖合成酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码麦芽糖基海藻糖水解酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述基因是以pET-24a或pETDue-1为载体进行表达。

本发明第二个目的是提供一种表达MTSase和/或MTHase的重组大肠杆菌的构建方法，是将编码MTSase和/或MTHase与载体连接，转化至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以pET-24a或pETDue-1为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以E.coli BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还可以以E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体如下：

1)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示目的基因连接到载体pET-24a上，转化E.coli JM109，涂布具有抗性的LB平板，PCR、双酶切验证阳性转化子，获取重组质粒pET-24a-treY或pET-24a-treZ；

2)将重组质粒pET-24a-treY或pET-24a-treZ转化进入大肠杆菌中，涂布具有抗性的LB平板，PCR、双酶切验证阳性转化子。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体如下：