[发明专利]一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组及其试剂盒。

背景技术

流感是一种病毒性感染，主要影响鼻、喉、支气管，并偶尔影响肺部。感染通常持续约一周，特征是突发高热、肌肉酸痛、头痛和严重不适、干咳、喉痛和鼻炎。通过染病者咳嗽或打喷嚏时产生的飞沫和微粒，病毒很容易在人与人之间传播。在季节性流行期间，流感往往迅速传播。多数染病者在一至二周内康复，无需进行医学治疗。但是，对幼儿、老年人和患有其它严重病症者，感染可根据内在情况导致严重的并发症、肺炎和死亡。季节性流感病毒以甲型流感病毒感染最多，其次为乙型流感病毒。其中甲型流感病毒中又以H1亚型和H3亚型病毒株为流行株或交替流行。目前，在临床和实验室，免疫学和分子生物学检测流感病毒最为常用。较常见的为ELISA检测试剂、荧光免疫检测试剂以及实时荧光PCR检测试剂。其中以实时荧光PCR检测试剂为代表的核酸检测产品一般是以咽拭子为样本，先进行样本核酸提取处理操作，再进行RT-PCR扩增操作，两个步骤缺一不可。直接扩增法是一种在扩增反应体系和核心原材料进行优化改造的基础上，实现了病毒裂解、核酸释放、RNA逆转录、PCR扩增步骤同管进行的技术方法，现有技术缺乏检测多种流感病毒的一管反应的试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组。

本发明的第二个目的是提供含有所述引物组的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种同时检测多种流感病毒的引物组、探针组，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1～8所示，探针组的序列如SEQ ID NO：9～12所示；所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒H1亚型及H3亚型。

本发明还提供一种同时检测多种流感病毒的试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物组和探针组；所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒H1亚型及H3亚型。

通过配制RT-PCR所需的各个试剂，将核酸提取和RT-PCR结合进行一步反应，本发明设计了一种试剂盒，所述试剂盒由直接RT-PCR反应液A、直接RT-PCR反应液B、样本稀释液、阳性质控品和阴性质控品组成。

其中，引物组和探针组在直接RT-PCR反应液A中，优选地，所述直接RT-PCR反应液A还含有Tris-HCl、MgCl₂、NP-40、Tween20、KCl。

更优选地，所述直接RT-PCR反应液A的组成为：0.2～0.5μM SEQ ID NO：1～8所示引物、0.1～0.3μM SEQ ID NO：9～12所示探针、10～60mM Tris-HCl、2～6mM MgCl₂、5～12mM NP-40、2～6mM Tween20、20～38mM KCl。

优选地，所述直接RT-PCR反应液B含有逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs和RNA酶抑制剂。

更优选地，直接RT-PCR反应液B的组成为：2.5U/反应的逆转录酶、5U/反应的Taq DNA聚合酶、0.6mm/反应的dNTPs、20U/反应的RNA酶抑制剂。

优选地，所述样本稀释液含有Tris-HCl、EDTA；Tris-HCl的浓度为80～100mM，EDTA的浓度为0.2～6mM；所述阳性质控品为甲型流感病毒、乙型流感病毒、季节性流感病毒H1亚型及H3亚型的扩增片段，含量为1.0 E5 copies/mL。

所述阴性质控品为生理盐水。

作为一种具体的实施方式，本发明所述直接RT-PCR反应液A的组成为：上述引物组和探针组、10mM Tris-HCl （pH7.5）、2mM MgCl₂、0.2%（V/V） NP-40，0.01%（V/V）Tween20，30mM KCl，其余为DEPC水。其中探针5’端分别任意标记FAM、HEX、Texas Red以及Cy5中的任一种，3’端标记BHQ1。

所述样本稀释液的组成为：80mM Tris-HCl （pH8.5）、0.2mM EDTA溶液。

所述阴性质控品成分组成为：生理盐水。

本发明还提供利用所述试剂盒检测多种病毒的方法，包括以下步骤：

（1）取200μl样本稀释液加入咽拭子样本中涡旋震荡10s以充分浸润和洗脱病毒颗粒得浸洗液；