[发明专利]一种2‑磷酸苄基甲酸酯类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测碱性磷酸酶的应用

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，更具体地，涉及一种2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物及其制备方法和作为荧光探针在检测碱性磷酸酶的应用。

背景技术

在临床诊断上碱性磷酸酶可作为一个重要的生物指标，在很多疾病中如骨骼疾病，肝脏功能障碍，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和糖尿病等中均可通过检测碱性磷酸酶的异常水平来进行初步诊断。碱性磷酸酶可来源于不同哺乳动物的骨、肝、胎盘和肠道，作为常见的分析酶，能催化水解多样的磷酸化合物并且具有底物特异性。目前有很多方法用于该碱性磷酸酶检测，但对碱性磷酸酶的检测缺少选择性，不能对人体血液或细胞内的碱性磷酸酶进行选择性检测，特别是细胞内含有的多种磷酸酶，而其中酪氨酸磷酸酶，色氨酸磷酸酶等，通常都可以与一般磷酸酶探针发生反应，进而影响检测的准确性。因此，设计对于碱性磷酸酶具有特异性识别的荧光探针具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物。该化合物具有邻位磷酸苄基基团，对于碱性磷酸酶的特异性识别能力，是一种简单，快速，灵敏，专一的碱性磷酸酶检测试剂。

本发明另一个目的是提供上述2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物的制备方法。

本发明再一个目的是提供上述2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物的应用。

本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现：

一种2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物，所述化合物的结构式如式(I)所示：

其中，X为O、NH或NCH₃，Dye为荧光基团。

优选地，所述荧光基团的结构式如式2-12所示：

上述2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物的制备方法，包括如下具体步骤：

S1.将2-羟甲基-苯基磷酸二乙酯和吡啶加入到二氯甲烷中，降温到0℃后，加入三氯甲基碳酸酯，氮气保护下反应4～8小时；

S2.用TLC板监测反应，反应完全后，用氮气吹干多余的三氯甲基碳酸酯；然后加入荧光基团，并反应12～24小时；

S3.用TLC板监测反应，反应完全后，加入二氯甲烷和水萃取，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，并用洗脱剂进行硅胶柱分离，得到化合物A；

S4.将化合物A溶解在二氯甲烷中，室温下加入三甲基溴硅烷，氮气保护，反应8～12小时；

S5.用TLC板监测反应，反应完全后，旋干溶剂，并用洗脱剂进行硅胶柱分离，得到2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物。

优选地，步骤S1中所述2-羟甲基-苯基磷酸二乙酯、吡啶、二氯甲烷、三氯甲基碳酸酯的摩尔比为1：(2～5)：(15～30)：(0.5～1.5)。

优选地，步骤S2中所述荧光基团与步骤S1中所述2-羟甲基-苯基磷酸二乙酯的摩尔比为1：(0.8～1.5)。

优选地，步骤S3中所述洗脱剂为乙酸乙酯和正己烷，所述乙酸乙酯和正己烷的体积比为1：(1～3)。

优选地，步骤S4中所述化合物A、二氯甲烷、三甲基溴硅烷的比例关系1：(20～30)：(3～5)。

优选地，步骤S5中所述洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为1：(0.2～1)。

上述2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物作为荧光探针在检测碱性磷酸酶的应用。

优选地，所述碱性磷酸酶存在于人体血液或细胞中。

本发明以2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物作为荧光探针，用以碱性磷酸酶的特异性识别。由于邻位磷酸苄基基团对于碱性磷酸酶的特异性识别能力，甲酸酯的吸电子效应，荧光基团的荧光被猝灭。碱性磷酸酶选择性识别并切除磷酸基团，产生的酚羟基负离子经过电子重排，最终释放出自由的荧光基团，产生荧光。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明利用特殊的空间位阻效应，提供一种具有邻位磷酸苄基基团，即2-磷酸酯苄基甲酸酯，对于碱性磷酸酶具有特异性识别的官能团，此结构可以实现对于碱性磷酸酶的特异性识别。而且2-磷酸酯苄基甲酸酯不与其他磷酸酶发生反应，例如肾小球上皮细胞蛋白(GELPP)，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)等，只与碱性磷酸酶反应，产生荧光，进而提高检测结果的准确性。

2.本发明2-磷酸酯苄基甲酸酯类化合物是一种简单，快速，灵敏，专一的碱性磷酸酶检测试剂，作为荧光探针可对模拟溶液中或细胞内碱性磷酸酶进行实时定性及定量的无损检测，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。