[发明专利]用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性消耗性传染病。根据世界卫生组织的统计，目前全球有超过1/3的人口感染了结核分枝杆菌，每年有200万人因结核病死亡。结核分枝杆菌除感染人外，还感染50多种哺乳动物和20多种禽类；在家畜中，牛最易感染牛型结核分枝杆菌而发生结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛，不但影响养殖业的发展，造成经济损失，而使人畜健康受到严重威胁。结核病是全球重要的公共卫生问题，在一些发达国家如德国、澳大利亚等国的人结核病患者中，约0.2％～0.3％是由牛型结核分枝杆菌引起的，而在埃塞俄比亚、尼日利亚、坦桑尼亚等不发达国家中，这个比例高达17.0％一26.1％。由此可见，控制牛结核病不仅对于动物疫病防治，还是对人健康，都具有重大的公共卫生学意义。

结核病的早期诊断对结核病的控制至关重要，而结核病防治的最大挑战之一就是缺乏早期、快速、敏感和特异的诊断工具。目前分枝杆菌菌种的鉴定，传统的分类、鉴定系统主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据，易受多种因素影响，鉴定结果极不可靠，存在着很大的异质性，鉴定一种菌种耗时长约4周，还不包括培养所需时间4-8周，因此有较大局限性。如PNB、TCH鉴别培养基进行菌种鉴定，虽然已被常规应用，但其为临床提供信息缓慢，而且鉴定出的菌种有一定局限性，只能区分出结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，不能进一步进行种的鉴定。

目前，应用分子生物学技术鉴定分枝杆菌菌种不仅快速可靠，而且具有成本低廉，可建立标准化操作程序的优点，成为快速鉴定分枝杆菌的新方法。基于牛型分枝杆菌PstS基因的特异性突变位点的分子生物学检测技术，高效、灵敏、特异度高，用于检测牛型结核分枝杆菌，可以将牛型结核分枝杆菌与其它分枝杆菌区分开。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明用于鉴定牛型结核分枝杆菌的SNP标记，所述SNP标记位于牛型结核分枝杆菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，该序列第53位碱基C为SNP突变位点。利用该特异性突变位点将牛型分枝杆菌从分枝杆菌中分离出来。

本发明所述牛型结核分枝杆菌PstS基因的部分核苷酸序列如SEQID No:2所示。

本发明还提供用于实时荧光定量PCR检测所述SNP标记的引物及探针，上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'，下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'。探针：5'-FAM-ACCAGGCTCATTTC-MGB-3'。

本发明还提供含有所述引物及探针的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述引物及探针或所述试剂盒在鉴定牛型结核分枝杆菌中的应用。

包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)以上述提取的DNA为模板，利用所述引物及探针，进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

其中，步骤2)中实时荧光定量PCR扩增反应体系：2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，上、下游引物及探针的终浓度为250nmol/L，DNA模板2μl，去离子水加至总量为20μl。

实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，59.3℃退火60s，共40个循环。

实时荧光定量PCR所用的仪器为BIO RAD MJ MiniOpticon。

步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析是否含有牛型结核分枝杆菌；含有牛型结核分枝杆菌的待测样品会出现扩增曲线，表现为阳性结果；不含有牛型结核分枝杆菌的待测样品不出现扩增曲线，表现为阴性结果。