[发明专利]天然形式人自分泌运动因子特异的抗体、其筛选方法以及检测试剂

说明书

本申请是申请人于2007年8月2日提交的题为“天然形式人自分泌运动因子特异的抗体、其筛选方法、以及通过测定自分泌运动因子而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂”的中国专利申请200780036898.6的分案申请。

技术领域

本发明涉及特异性识别并结合天然形式人自分泌运动因子(autotaxin)的抗体、其筛选方法、以及通过测定人样品中的自分泌运动因子浓度而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂。

背景技术

人自分泌运动因子是具有约125kDa分子量的糖蛋白，该蛋白质在1992年首次由M.L.Stracke等从A2058人黑素瘤细胞的培养基中作为诱导细胞运动性的物质分离(J.Biol.Chem.,256,2524,1992)。随后，1994年J.Murata等使用cDNA克隆分析其结构，明确了该蛋白质在氨基末端侧具有单一跨膜部分，在胞外结构域中包含2个生长调节素B区、I型磷酸二酯酶活性区、和EF手型的环区，具有磷酸二酯酶活性(J.Biol.Chem.,269,30479,1994)。然而，仍没有获得任何明确的涉及自分泌运动因子诱导细胞运动性的功能的证据。2002年，在人(A.Tokumura等,J.Biol.Chem.,277,39436,2002)和牛血清(M.Umezu-Goto等,J.Cell Biol.,158,227,2002)中鉴定到新的溶血磷脂酶D，从而首次证实由这种酶活性所产生的溶血磷脂酸诱导细胞运动性。

基于自分泌运动因子运动性诱导功能的推断，Stracke等在美国专利号5,499,753(1995)中描述使用自分泌运动因子作为人癌侵润能力的标志物。此外，Stracke等也在美国专利号5,731,167(1998)中提出通过施用与毒素结合的抗自分泌运动因子抗体的癌症疗法。这样就需要特异性识别人自分泌运动因子的抗体，但由于自分泌运动因子相对大量地以多种形式含于动物血清中，故认为极难获得针对通常存在于血清中的没有经历突变的自分泌运动因子(天然形式的自分泌运动因子)具有特异性和强大结合力的抗体。实际上，没有用于定量自分泌运动因子本身的方法，并且目前通过评价其具有的溶血磷脂酶D活性间接地定量自分泌运动因子。用于测定这种酶的活性的方法是复杂的并且通常需要几个小时与底物的孵育时间以使此酶发挥酶活性。此外，还存在干扰性因素，如可能在人样品中存在与自分泌运动因子不同的具有溶血磷脂酶D活性的其它酶、在人样品中存在因酶活性测定期间溶血磷脂酰胆碱底物分解而产生的溶血磷脂酸和胆碱。这些内在因素至少对酶活性测定中人自分泌运动因子的特异性定量产生一些影响，不是用于定量人自分泌运动因子的高精度方法。实际上，胆碱以约数十mM的浓度含于人精浆中，并且若没有进行胆碱去除的预处理，则难以基于使用溶血磷脂酰胆碱作为底物所生成的胆碱量而测定精浆中的活性。

为数众多的单克隆抗体已经由几个研究组(包括我们的研究组)通过用大肠杆菌(Escherichia coli)表达人自分泌运动因子的合成的部分肽或部分序列、免疫可溶性人自分泌运动因子而建立(Journal of Biological Chemistry,269,30479-30484,1994,FEBS Letters,571,197-204,2004)。然而，尽管人自分泌运动因子可以通过使用这些抗体的蛋白质印迹法检测，然而这些抗体对人样品中存在的天然形式人自分泌运动因子不表现任何反应性或仅表现极低水平的反应性。因此，极难将这些抗体应用于以人样品为对象的ELISA测定法等免疫学测定法中，并且它们仍没有实际使用。

根据本发明，可以极高效地建立与人样品中天然形式的人自分泌运动因子特异性反应的单克隆抗体。也就是说，在通过抗原免疫、细胞融合而制备单克隆抗体时的筛选方法中，通过选择以与溶液中存在的天然形式抗原的反应性作为指标的抗体，可以建立基于通用方法如ELISA的人自分泌运动因子定量测定体系。此外，由所述方法获得的抗体是高性能抗体，其通过能够高效结合并捕获含于血液等中的人自分泌运动因子，不仅能够自样品除去抗原，还能够纯化抗原。

发明公开