[发明专利]用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物及其应用

权利要求书

1.一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，

所述MeJB3F的核苷酸序列为：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；

所述MeJB4.5R的核苷酸序列为：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。

2.一种可用于检测猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照液，所述阳性对照液包括猪长刺后圆线虫DNA。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl70μl、pH值为8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值为8.0的25mM EDTA150μl、1％W/V十二烷基硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl组成。

5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物混合液中，所述MeJB3F和MeJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。

7.一种如权利要求1所述的特异性引物在检测猪长刺后圆线虫的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述特异性引物制成检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特异性引物，所述检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)DNA的提取：取待测虫体样品用双蒸水反复吹打冲洗，移去双蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃温箱中16-18h，再提取DNA，制备得到样品DNA；

(2)PCR扩增：取灭菌ddH₂O、PCR反应液、Taq酶和引物混合液按适合的PCR反应体系加入离心管中，混匀后分装放入多个离心管中制得多份分装液，取步骤(1)制备的样品DNA，每一样品DNA对应加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；

(3)PCR产物观察：取步骤(2)制备的PCR扩增产物依标号加样于1.0％琼脂糖凝胶上，120～130V电压电泳20～40分钟后，置于紫外透射仪下观察是否出现条带，若存在400bp～410bp大小的条带，则待测虫体样品为猪长刺后圆线虫；若不存在400bp～410bp大小的条带，则待检测虫体样品不是猪长刺后圆线虫。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR反应体系为缓冲液2～3μL、25mM的MgCl₂溶液3～4μL、2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25～0.3μL、样品DNA0.8～1μL、引物混合液0.8～1.2μL，余量为ddH₂O补至25μL。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、52～58℃退火30sec、72℃延伸30sec，共38个循环；72℃延伸5min。