[发明专利]用于检测猪复阴后圆线虫的特异性引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪复阴后圆线虫的特异性引物及其应用。

背景技术

猪后圆线虫为圆形目、后圆科、后圆属，是猪复阴后圆线虫、长刺后圆线虫、萨姆氏后圆线虫3种后圆线虫的总称，猪后圆线虫病是一种由线虫寄生于猪支气管和细支气管的线虫病，由于虫体呈丝状，寄生于肺脏，故又称猪肺丝虫病或肺线虫病。

猪后圆线虫对羊、牛、猪均易感，偶见于羊、鹿、牛和其他反刍兽，亦偶见于人，主要发生在幼猪，死亡率较高，危害较大。猪肺丝虫病呈地方性流行，在河谷区和低热区多发。在我国，江西省猪后圆线虫病感染率为40％，辽宁省为59.81％，湖南省为5.93％，河北省为18.5％，江苏省为43.6％，四川省为20.7，并呈明显的逐年上升趋势。

对猪后圆线虫病的准确诊断是有效防控此病的前提，现有的检测方法主要根据临床症状、流行病学情况、病理变化、进行初步诊断，并进一步结合粪便检查虫卵进行确诊，虽然现有检测方法简单易行，对成虫有一定的准确性，但对于形态上难以区分种类。特别是各种线虫在虫卵和幼虫阶段难以区分，而且猪复阴后圆线虫、猪长刺后圆线虫、猪萨姆氏后圆线虫3种后圆线虫彼此也难以区分，同时现有的检测方法检测效率、检测准确性较低、检测结果受检测人员经验影响大。

因此，有必要对现有猪复阴后圆线虫检测做进一步开发，提供一种检测方法检测效率高、检测准确性高、检测结果受检测人员经验影响小的检测试剂盒及其使用方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种用于检测猪复阴后圆线虫的特异性引物及其应用，其具有检测结果准确、检测效率高的优点。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

本发明提供一种可用于检测猪复阴后圆线虫的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物MpJB3F和下游引物MpJB4.5R，

MpJB3F的核苷酸序列为5'-ACTCGCATATATTTGTATAATATATG-3'；

MpJB4.5R的核苷酸序列为5'-TTTCATTCATCGACGCAAAATTCAT-3'。

通过比对多种猪后圆线虫cox1基因，针对较稳定保守区设计所述MpJB3F和MpJB4.5R，预期扩增片段大小约为500bp左右。引物序列中G+C含量为40％～60％，上下游引物不存在二级结构，互配可能性低，引物具有特异性。

本发明还提供一种可用于检测猪复阴后圆线虫的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括上述的特异性引物。

上述猪复阴后圆线虫的检测试剂盒，还包括阳性对照液，所述阳性对照液包括猪复阴后圆线虫DNA。

上述猪复阴后圆线虫的检测试剂盒，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值为8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值为8.0的25mM EDTA 150μl、1％W/V十二烷基硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K 200μl组成。所述DNA裂解液采用适宜的比例配置，避免资源浪费。

上述的检测试剂盒，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。

上述的检测试剂盒，所述引物混合液中所述MpJB3F和MpJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。

本发明还提供一种如上述的特异性引物在检测猪复阴后圆线虫的应用。

上述的应用，利用所述特异性引物制成检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特异性引物，所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)DNA的提取：取待测虫体样品用双蒸水反复吹打冲洗，移去双蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃温箱中16-18h，再提取DNA，制备得到样品DNA；

(2)PCR扩增：取灭菌ddH₂O、PCR反应液、Taq酶和引物混合液按适合的PCR反应体系加入离心管中，混匀后分装放入多个离心管中制得多份分装液，取步骤(1)制备的样品DNA，每一样品DNA对应加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；