[发明专利]基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于焦磷酸测序的DNA测序装置，具体是涉及一种基于焦磷酸测序的基于焦磷酸测序的DNA测序装置及系统，属于基因检测领域。

背景技术

一、焦磷酸测序概况

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是于1987年发展起来的、基于DNA合成过程中释放的焦磷酸(PPi)检测的测序技术，焦磷酸测序反应在一系列酶的催化作用下的，其过程中会产生与脱氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合数目成比例的可见光，通过对可见光检测可达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序有两种实现方法：液相焦磷酸测序法(Liquid Phase Pyrosequencing)和固相焦磷酸测序法(Solid Phase Pyrosequencing)。

液相焦磷酸测序是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sμLfurylase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)协同作用下，将引物DNA上每一个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的(马永平等，焦磷酸测序技术及其在分子生物学领域的应用[J].国外医学分子生物学分册2003，25(2):115-117)。

液相焦磷酸测序的反应体系由反应底物、待测单链、特异性测序引物和酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS)和荧光素(1uciferin)。液相焦磷酸测序反应过程是一个向反应体系中轮流加入4种dNTP参与反应的过程，每轮反应只有一种dNTP参加。如果加入的dNTP刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则其在DNA聚合酶的作用下被添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS结合形成ATP；在荧光素酶的作用下，生成的ATP又和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。如果加入的这种dNTP刚好能和DNA模板的下面连续n个相同碱基匹配，根据反应方程式可知，释放出的可见光强度应是只有1个碱基匹配时的n倍，也即反应过程中释放的光强度与相匹配的碱基数目成比例关系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一个碱基不匹配，则上述反应不会发生，也没有可见光的释放。未参加反应的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。

每轮反应释放出的可见光通过微弱光检测装置转化，再被处理为数字信号，经PC软件处理即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低应和相匹配的碱基数目成比例关系。

待上一轮反应结束后，加入另一种dNTP，重复进行上述反应。最终可根据获得的光强度峰值图即可读取的待测DNA序列信息。

需要注意的是：dATP的降解产物脱氧单磷酸鸟苷(dAMP)是荧光素酶的抑制剂，随着反应的进行，其浓度会越来越高，会阻碍焦磷酸测序化学发光反应的继续进行。这也是焦磷酸测序法测序长度较短(通常为20bp～30bp)的主要原因(Shendure J，et a1.Advanced sequencing technologies:Methods and goals，Nat.Rev Genet.，2004，5(5):335-44)。

固相焦磷酸测序是由3种酶催化的化学发光反应，与液相焦磷酸测序相比，没有三磷酸腺苷双磷酸酶参加。固相焦磷酸测序反应过程如下：结合了引物的DNA模板被固定于支撑物上并在反应过程中保持位置不变；加入一种dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶协同作用下发生反应，除了没有降解反应发生，其他反应与液相焦磷酸测序完全相同；在加入下一种dNTP前有一个冲洗步骤(washing step)将上轮反应残留物完全冲走，不会有抑制性产物的堆积。

通常情况下，人们所说的焦磷酸测序法指的是液相焦磷酸测序法，因为其四酶反应系统使得焦磷酸测序可以很方便地在单管中实现。