[发明专利]快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及家畜饲养及疾病防治领域，尤其是一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒。

背景技术

鸭瘟(Duck plague，DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis， DVE)，是由疱疹病毒科的鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽类的一种急性、热性、败血性传染病，主要临床特征为体温升高、两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头、颈部肿大，故该病在我国有些地方俗称“大头瘟”。鸭瘟自1923年首次在荷兰报道，之后在世界各地许多养鸭国家均报导有该病的发生和流行，我国于1957年在广州首次发现该病。多年来鸭瘟以高达90％的死亡率引起社会广泛关注，另外该病传播速度很快，加上集约化养鸭业鸭群密度高、流动频繁、极易引起流行，而且该病在一个大流行期后常呈地方性流行，长期危害养鸭业，造成巨大的经济损失。

目前对鸭瘟病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、ELISA法、血清中和试验及PCR技术等。但病毒分离鉴定方法在低毒力或非致病性毒株情况下可能不引起临床症状；血清学中和试验虽然结果准确，但程序复杂，耗时费力，不能用于快速诊断及大批量样品的检测；ELISA是目前使用最为广发的一种方法，具有经济、简便、快速的特点，但灵敏度较PCR技术而言稍有差距；传统PCR技术具有灵敏度高、特异性强等特点，但该检测方法成本高，对操作者技术及反应仪器要求较高，扩增反应时间较长，不利于快速检测及在基层实验室的推广应用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法，原理是利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA，在1h内能达到 109靶序列拷贝。

发明内容

本发明的目的是：提供一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，它能快速、准确的对鸭瘟病毒进行检测，并且成本低廉，使用方便，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，在 25μL体系DPV-TK LAMP扩增体系中包括，浓度为5mol/L的甜菜碱5μL，浓度为8000U/mL Bst DNA的聚合酶0.8μL，浓度为0.1mol/L 的硫酸镁1.0μL，浓度为0.25mol/L的dNTPs 1.4μL，浓度为 10pmol/μL的外引物F3/B3各0.5μL，浓度为10pmol/μL的内引物 FIP/BIP各4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBR GreenI，其余由无核酸酶ddH₂O补足至25μL，其中，外引物F3的序列为 5’-TGCGAACGCTTAATCCGG-3’，外引物B3的序列为5’- TGCTATGTCACCTCGAGCT-3’；内引物FIP的序列为5’- GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’，内引物BIP的序列为5’-GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’；该体系在62℃扩增60min。

为了验证本发明的技术效果，进行了以下试验：

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株 本试验的DPV活疫苗(鸡胚化弱毒株)购自南京天邦生物技术有限公司，鸭疫里默氏杆菌标准菌株购自中国兽医微生物保藏管理中心(CVCC)；DPV Gz株由贵州大学动物科技学院惠赠；DPV CHv强毒株、大肠杆菌、鸭疫里默氏巴氏杆菌、鸭沙门氏菌由本实验室分离鉴定后保存。

1.1.2试剂和仪器 Bst 2.0DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；Betaine(甜菜碱)、MgSO₄购自Sigma公司；dNTPs、无核酸酶ddH₂O、DL500DNA Maker、基因组DNA提取试剂DNAiso Reagant、购自宝生物(大连)工程有限公司；Gold view核酸染料、 50×TAE Buffer购自生工生物工程(上海)股份有限公司；梯度PCR仪 (Veriti)，Applied Biosystems公司；凝胶成像仪(Alpha Imager HP)，美国Alpha Innotech公司。