[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞领域，更具体的，涉及一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够自我更新，具有多向分化潜能的祖细胞。在成骨不全、造血功能不全、骨组织的再生等疾病的治疗中，均可分化为相应终端分化细胞。在再生医学治疗领域，以间充质干细胞为基础的细胞治疗方法由于其自我更新和多向分化的潜能，越来越受到人们的青睐。从脐带中也可以分离MSCs很早就已经被J.W.Kim等人证明，带标本中不仅能够分离得到了MSCs，而且也通过成脂诱导，成骨诱导验证了MSCs具有分化潜能，对MSCs的分离及培养是脐带间充质干细胞得以良好应用的重要保证，目前大多数MSCs的分离及培养方法难以实现规模化生产。

中国专利文献公开号CN103421739A公开了一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，使用插管分离脐带间充质干细胞以及使用trypLETM消化和无血清培养基培养脐带间充质干细胞的步骤。本发明虽然能够更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小，但其培养方式简单，不适合大规模生产，加工效率有限，工业化生产前景局限。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法对胶体进行分离，能够获得数量可观的原代细胞，适合大规模工业化生产。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，按如下步骤实施：

SOO:胶体分离步骤：从采集瓶内取出脐带，测量所述脐带长度并记录，对所述采集瓶内部的保存液进行支原体检测；将所述脐带移送至无菌培养皿内，对所述脐带进行冲洗及去血渍并将所述脐带裁剪成数段；剔除所述脐带内部的血管及羊膜；从所述脐带中分离出华通氏胶，对所述华通氏胶进行洗涤；

S10：组织块制备步骤：将所述华通氏胶转移至离心管，对所述华通氏胶进行离心处理；对所述离心管内部的洗涤液进行无菌检测，并对所述华通氏胶进行称重；向所述华通氏胶内部加入用于培养脐带充质细胞的专用培养基；将所述华通氏胶剪切成组织块，其与所述专用培养基混合后，形成组织块匀浆；

S20：接种处理步骤：依据所述华通氏胶的重量继续加入适量所述专用培养基，直至所述组织块匀浆的浓度与预设浓度保持一致；采用电动移液器对所述组织块匀浆进行吹打，使其均匀混合；将所述组织块匀浆分成若干份，分别加入若干培养瓶内进行接种，并在若干所述培养瓶内加入所述专用培养基；

S30：原代细胞培养及收获步骤：平置所述培养瓶使得所述组织块匀浆均匀分布于所述培养瓶的底部；将所述培养瓶置于含有二氧化碳且恒温恒湿的培养箱内；对所述培养瓶内部的所述专用培养基进行换液处理；当所述培养瓶内部的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；对所述定容离心管内部的混合物进行过滤，并将滤液收集至所述定容离心管内；

S40：原代细胞传代步骤：观察装有原代细胞单个所述离心管内部的余下细胞沉淀量，依据所述余下细胞沉淀量合并多个所述离心管的内容物至一个离心管内；加入适量的氯化钠注射液并吹打重悬浮细胞，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致。去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶；

S50：细胞传代步骤：当传代细胞的融合度与预设融合度一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶。