[发明专利]一种牙髓干细胞分离培养方法

权利要求书

1.一种牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，分离干细胞，将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30min；

S2，制备单细胞悬液，加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液；

S3，细胞种瓶，原代细胞种植密度采1×10⁴cell/cm²，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶；

S4，形成克隆，2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代；

S5，细胞传代，按1×4000cell/cm²种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生长达到70％～90％的汇合度时，进行传代细胞收获并再次传代。

2.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于：在S1步骤中，牙齿采用新鲜牛奶或者无菌生理盐水保存，或者添加S/P抗生素的PBS缓冲液，在1℃至5℃之间的温度进行保存，保存时间不超过48h。

3.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于：在S1步骤中，清洁牙齿时，需要将牙齿表面的牙龈和周围的组织刮去，依次使用碘酒和70％酒精清洁牙齿表面，防止口腔细菌的污染，之后再用生理盐水洗涤5次，去除碘酒和酒精。

4.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于：在S4步骤中，首次换液时需移除没有贴壁的细胞。

5.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于：在S5步骤中，细胞的传代收获采用第二代至第四代传代细胞。

6.如权利要求1所述的牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于：在S1至S5步骤中，细胞的培养温度为37℃，CO₂的体积百分比为5％。