[发明专利]一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种香菇L9015菌种的SSR标记指纹图谱的鉴定方法，其具体步骤如下：

(1)菌丝培养：将香菇菌种转接到装有100ml马铃薯葡萄糖培养基PDB的三角瓶中，23-25℃下避光摇瓶培养，3-5d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

a将-20℃冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45-60min，间或轻摇混匀；

b 12000rpm、4℃离心20min，取上清液；

c在上述上清液中加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

d在上述离心管中加入体积比为2∶1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

e在上述另一离心管中加入相对于上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

f将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钾洗涤2-3次，每次8000rpm，室温离心5min；

g加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

h加入100μL 1×TE冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；

i加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

j将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 10.4μL；

PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与2μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6％，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；

银染的具体工艺为：电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分后，在银染液中避光银染8min，银染后，用去离子水水洗5-8s，沥干水分，放入显影液中，至显影后取出水洗后即可读数；银染液、显影液均可用3-4次；

采用8对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp ladder DNA marker可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到带型符合编号组合为：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)的菌种，即可确定该菌种为香菇L9015菌种；

其中，8对SSR引物序列如下：

1140正向引物：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA；

反向引物：AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；

76正向引物：AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC；

反向引物：ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG；

43正向引物：CTCTTTGCACCCTCAACCTC；

反向引物：CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC；

16正向引物：ATAGGATGATTGAACGAGCAG；

反向引物：ACCGTAAGGTGGGAAGAAA；

19正向引物：ATGCCGTTCCAAAGATAC；

反向引物：TTGAAGCCTGACAGAGTG；

148-1正向引物：CATTGCTCGGATCCTTCATT；

反向引物：TACCTCGTGCGGACTTTGAT；

002正向引物：GGGCGAAACAATTTCAGGTA；

反向引物：ATGCCATCGTAAGGAACTCG；

192-1正向引物：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT；

反向引物：AAGCGATATGGATTTGACGC。