[发明专利]一类可调控的腐胺生物荧光传感器及其应用

说明书

一类可调控的腐胺生物荧光传感器及其应用，将含有对腐胺具有响应的人工设计启动子的重组质粒pAR2gfp、pLR2gfp、pAR3gfp、pLR3gfp、pTacR2gfp、pTacR3gfp转入大肠杆菌MG1655中，建立了一种绿色荧光蛋白标记的生物荧光检测系统，当环境中存在腐胺时，诱导启动GFP_mut3蛋白表达，此时检测荧光强度。本发明利用荧光标记技术构建腐胺生物荧光传感器，通过检测荧光强度对腐胺进行定性及定量分析，为腐胺检测提供技术和方法，同时通过改变腐胺识别元件PuuR的表达水平和培养基可以调节传感器的响应范围，在生产菌株的筛选和实时监测腐胺合成过程以及环境检测等方面有很重要的应用。

技术领域

本发明涉及一种分子生物学与合成生物学领域的技术，具体是一种遗传编码的腐胺生物荧光传感器，用于定性和定量检测外界环境中腐胺浓度、腐胺生产菌株的生产能力以及实时监测腐胺合成过程。

背景技术

腐胺，又名1，4-二氨基丁烷或1，4-丁二胺，含有两个氨基功能基团，使它在化学工业上有很广泛的用途及市场。例如，腐胺可以作为多聚物、药物、农产品及其他添加剂的成分等，特别是，腐胺与己二酸通过缩聚反应合成尼龙-4，6材料(Yamanobe等人，J.Mol.Struct.，829：80-87，2007)。传统的化学合成是采用琥珀腈氢化方法(Sanders等人，Macromol.Biosci.，7：105-117，2007)有一定的缺陷和局限性(以不可再生的石油化学产品作为原料、需要严苛的温度、压力等反应条件、昂贵的催化剂系统、而且原材料有毒并可燃，造成环境污染等方面)。为了获得安全、可靠、低成本的绿色生产方法，科学家们想到了利用微生物合成的方法，研究高效生产腐胺的微生物工程菌株，利用可再生的碳水化合物和无机盐生物制造腐胺，从而最终取代当前的石化路线。为了进一步获得高产菌株，需要采用随机突变建库和高通量筛选富集高产菌株，目前高通量筛选高产突变株方法工作量大，周期长，效率低和成本高；而且检测腐胺产量方法繁琐，低通量，只能实现离线检测等，这些都是微生物实现大规模地工业化生产腐胺的瓶颈和障碍。

腐胺普遍存在于细菌、植物及动物体中，广泛参与蛋白合成、DNA复制、转录、翻译及后翻译修饰等生理代谢过程，因此在生长及发育等方面具有重要的功能(Tkachenko等人，Arch.Microbiol.，176：155-157，2001)，其生理功能使它在肿瘤研究中可以作为一种重要的生物标记用于检测肿瘤的形成(Russell等人，Cancer Res，31:1555-1558，1977；Russell等人，Nature，37：214-221，1971；Bachrach等人，CRC Press，pp 235-250，1989)。但是，过量的腐胺其本身具有一定毒害性，且广泛存在于发酵型食物之中，含有大量腐胺的食品(奶酪，香肠，熏肉，红酒等))也会给消费者的身体造成极大的健康隐患。

目前传统的腐胺的测定方法，例如柱前衍生高效色谱法、荧光探针法，、薄层色谱法和电泳法都比较复杂和繁琐，需要额外的样品制备，且其分析速度慢，更重要地，无法实现实时监控代谢动态过程，都属于离线检测范畴。我们构建的腐胺生物传感器检测法能够避免耗时的样品处理，并且与传统的气液相方法相比具有更高的通量性，同时能够实时的监测活细胞中代谢物的动态变化过程，这都是传统液相法不可能实现的。