[发明专利]柴胡粗酶的提取及酶活性检测方法

权利要求书

1.一种柴胡粗酶的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）准确称量每棵柴胡种苗根部的重量；

（2）向柴胡种苗根部加入PBS，冰浴研磨成匀浆；

（3）将匀浆放置冰箱中，浸提；

（4）在0-4℃下离心，去除沉淀取上清液；

（5）重复步骤（4），上清液离心后取上部清液，即得到柴胡粗酶液。

2.根据权利要求1所述的柴胡粗酶的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，PBS的浓度为0.01Mol/L，PBS的pH值为7.15。

3.根据权利要求1所述的柴胡粗酶的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，柴胡种苗根部的克数与PBS的毫升数之比为1:18。

4.根据权利要求1所述的柴胡粗酶的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，浸提时间为2小时；步骤（4）中，离心转速为10000 rmp/min，离心时间为20 min；步骤（5）中，得到的柴胡粗酶液保存于-20℃，分装，避免反复冻融。

5.一种柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据权利要求1-4任一项所述的提取方法得到柴胡粗酶液；

（2）利用酶联免疫法ELISA对所述柴胡粗酶液中的HMGR、IPPI、FPS和/或β-AS进行酶活性检测。

6.根据权利要求5所述的柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，所述酶联免疫法ELISA的检测步骤如下：

①标准品的稀释：标准品加入标准品稀释液进行稀释；

其中，标准品为HMGR、IPPI、FPS或β-AS的提纯品；标准品稀释液为ELISA底物液；

②加样：在酶标仪包被板上分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；

其中，酶标仪包被板用纯化的HMGR、IPPI、FPS或β-AS的抗体包被；在标准孔中加入稀释后的标准品，待测样品孔中先加样品稀释液，然后再加待测样品；待测样品为柴胡粗酶液；样品稀释液为ELISA底物液；

③温育：用封板膜封板后，放置于37℃温箱中，温育30-60 分钟；

④洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，洗涤，拍干；

⑤加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外；

其中，酶标试剂为HRP标记的纯化的HMGR、IPPI、FPS或β-AS的抗体；

⑥温育：用封板膜封板后，放置于37℃温箱中，温育30-45 分钟；

⑦洗涤：揭去封板膜，按照操作④再次进行洗涤；

⑧显色：每孔先加入显色剂A，再加入显色剂B，混匀，37℃避光显色10-15分钟；

其中，显色剂A为TMB-过氧化氢尿素应用液；显色剂B为HRP；

⑨终止：每孔加终止液，终止反应；

⑩测定：以空白孔调零，450nm 波长测量各孔的OD值；

⑪计算：以稀释后的标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘出标准曲线，用稀释后的标准品的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD 值代入方程式，计算出待测样品中相应酶的浓度，再乘以待测样品稀释倍数，即为待测样品中相应酶的实际浓度。

7.根据权利要求6所述的柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，步骤①和②中，ELISA底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液pH 5.0，其中，0.1mol/L柠檬酸，24.3ml；0.2mol/L Na₂HPO4·12H₂O，25.7ml；加H₂O，50ml；4℃存放备用。

8.根据权利要求6所述的柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，步骤④中，洗涤液：NaCl 2.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，氟化钠 0.2g，H₂O至1000ml，吐温20 0.5ml；4℃保存备用。

9.根据权利要求6所述的柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，步骤⑨中，终止液为2M H₂SO₄。

10.根据权利要求6所述的柴胡粗酶的酶活性检测方法，其特征在于，

步骤①中，标准品的稀释：原倍标准品一支，按照下列方式进行稀释：

5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液；

4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液；

3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液；

2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液；

1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液；

步骤②中，在标准孔中加入稀释后的标准品50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；

步骤⑧中，每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl；

步骤⑨中，每孔加终止液50μl，终止反应。