[发明专利]一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒

权利要求书

1.一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒包含Fuc-POSTN半定量检测ELISA板、ELISA酶标板、磁珠-AAL、Hp-ELISA酶标板；所述的Fuc-POSTN半定量检测ELISA板由POSTN-ELISA板、Protein-ELISA板组成；

所述Hp-ELISA酶标板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL糖酰胺酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。

2.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒的HCC预测模型：

P＝exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)/[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)]

Fuc-POSTN值的计算方法为每个血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值与相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值通过POSTN-ELISA板检测得到，相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和肝硬化的Cut off值为2.281；

基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包含POSTN捕获抗体，其浓度为1μg/mL；

还包含第一封闭剂和第二封闭剂，第一封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭POSTN-ELISA板，第二封闭剂为含有1.5％BSA和0.06％NaN₃的溶液，用于封闭Protein-ELISA板；

还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mM NaIO₄和50mM柠檬酸的溶液，用于POSTN-ELISA板的氧化；

还包含生物素标记的POSTN和生物素标记的抗体；

还包含采集血样装置及操作说明书。

3.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包括：

样品稀释液，所示样品稀释液为0.15M Tris-HCl、0.18M NaCl、1.5mM CaCl₂、1.5mM MgCl₂、pH 7.5的溶液；

还包括HPR标记的Hp抗体。

4.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述磁珠-POSTN中磁珠与POSTN的质量比为170～230:1；所述磁珠-POSTN拆分为磁珠、POSTN及磁珠-POSTN的制备相关试剂。

5.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述G1的容积是100μL，G2的容积是60μL，G3A的容积是20μL，G3B的容积是20μL，G4的容积是45μL，GW的容积是4.5mL。

6.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述磁珠-POSTN的制备方法包括步骤：

1)将磁珠置于EDC溶液中反应；

2)反应完成后，移除上清并用缓冲液清洗磁珠；

3)取一定量的POSTN置于偶联液中，加入磁珠反应；

4)反应完成后，封闭未反应的活化基团。

7.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒使用方法，包括下列步骤：

在不同试管中先加入2.5μL的含POSTN样本血清，再分别加入5μL G1、AAL，使用漩涡振荡器充分混匀，在98℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品；

在含G1样品试管中加入3.5μL的G2，在含POSTN样品试管中加入3.5μL的生物素标记的抗体和3.5μL POSTN捕获抗体；混匀离心，在培养箱中37℃保持4小时再冷却到4℃，对冷却后的样品分别加入60μL的去离子水GW终止反应-20℃保存；

分别取15μL低温保存的样品在金属浴中干燥100分钟，再冷却到4℃，对干燥后的含有G1、G2样品试管中加入2.5μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入120μL的GW进行终止反应，混匀离心后-20℃保存；取2.5μL终止反应后样本加入2.5μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃，保持20小时，再加入50μL的GW终止反应，混匀离心后取样15μL通过基因测序仪进行N-寡糖链片段分离检测，余液-20℃保存；

在干燥后的含有POSTN和3.5μL的生物素标记的抗体的样品试管中，利用HCC预测模型，计算Fuc-POSTN值，Fuc-POSTN值的计算方法为每个血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值与相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值的比值，血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值通过POSTN-ELISA板检测得到，相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，利用HCC预测模型区分肝癌和肝硬化的Cut off值。