[发明专利]白芨体细胞胚诱导及成苗方法

说明书

技术领域

本发明属于中药材组培技术领域，涉及一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法。

背景技术

白芨又名白根、地螺丝、白鸡娃、羊角七、紫兰、刀口药、连及草等，为兰科白芨属植物白芨的干燥块茎。白芨性温、味苦、甘、辛，药用价值较高，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮的功能，主要用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、 鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、汤火灼伤、手足皱裂等， 是我国民间的传统中药。白芨除了具有重要的药用价值外，还应用于保健食品、纺织印染、特种涂料、日用化工等各行业领域，需求量日趋增多，现已被列入《濒危动植物种国际贸易公约》予以保护。

白芨的繁殖有有性繁殖和无性繁殖两种，在有性繁殖中，由于白芨种子培育过程烦琐，生长速度慢，出苗率低，在自然状态下极少能萌发成苗。白芨的无性繁殖主要利用地下假鳞茎和地上茎进行繁殖，但是长期的无性假鳞茎和地上茎繁殖，假鳞茎和地上茎中容易滋生真菌和积累病毒，在进行组培苗时，组培苗容易被污染，导致繁殖速度减慢，成苗率低，品种种性退化的问题。

白芨除了利用假鳞茎和地上茎进行无性繁殖外，还可以利用茎尖生长点和无菌实生苗进行无性繁殖，该繁殖方法取材料较难，且该方法从脱分化、原球茎增殖、分化、炼苗至大田移栽周期至少需要24个月，培养周期过长，且培养期间需要更换8-10次培养基，工作量大，成本高，一般的药材种植企业和药农无法承担高昂的种植成本。

发明内容

针对现有技术中白芨的无性繁殖存在繁殖速度慢、培养周期长、成本高、地下假鳞茎和地上茎等外植体中容易滋生真菌和积累病毒，造成品种种性退化的问题，本发明提供一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法，具体方案包括以下步骤：

（1）种子准备：选用未开裂的白芨新鲜蒴果里的种子作为体细胞胚诱导体，蒴果用洗衣粉或肥皂洗净，洗干净后，将蒴果放于超净工作台上的烧杯中，烧杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡结束后，用无菌水冲洗蒴果3～4遍，冲洗结束后，将蒴果放到灭菌的培养皿中进行吹风，待蒴果被吹干后，剖开蒴果，留取种子，得到白芨体细胞胚诱导体，备用；

（2）培养基准备：在容量为1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸馏水，20000~30000 mg的硫代硫酸钠，100~150 mg的维生素C，1.0~5.0 mg的活性炭，1.0~10 mg的氯化钠和30000 mg的蔗糖，60~80 g的香蕉，100~120 mL的椰乳，最后再加蒸馏水使容量瓶的液体体积达到1 L，配制成培养基，培养基的pH值在5.4~5.8之间；将配好的培养基按250 mL/瓶分装至培养瓶中，放入高温灭菌锅中灭菌25 min，温度控制在121 ℃，备用；

（3）实验室培养：在超净工作台里按无菌操作要求打开（2）步骤中经过高温灭菌的培养瓶的瓶盖，用镊子夹取（1）步骤中得到种子并伸进培养瓶口，用镊子尖后部在瓶口轻轻敲击，使得种子均匀撒落在培养基上，盖好瓶盖，将培养瓶拿出超净工作台，将装有种子的培养瓶放于细胞振荡培养箱中进行振荡暗培养，振荡速度为100 r/min，培养的温度控制在20~25 ℃之间，培养到第5 d，种子吸水、种皮充胀，此时，向培养瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20~25 mL；此后，每间隔10 d向培养基中添加同量的白砂糖溶液；培养到种子的种皮胀裂时，向培养瓶中添加0.1~0.5 mg/L甲硫达嗪浸泡种皮，进行愈伤组织上分化出体细胞胚的诱导，即原球茎的诱导；此后进行光培养，光照强度为2500 lx，光照时间为12 h/d；培养到50 d，种皮破裂处可见大量的愈伤组织，愈伤组织上分化出体细胞胚，即原球茎；培养到60 d，原球茎胚芽开始萌发，可见胚芽生长点时，停止振荡培养，得到培养物；

（4）大棚炼苗培养：将实验室培养60 d的培养物和培养基倒入食物搅拌器中，低频搅拌打散20~30 min，转速控制在300 r/min，然后用孔径为0.3 cm × 0.3 cm的喷壶将搅拌后的培养物和培养基均匀喷撒于苗盘内进行培养，每间隔7 d，向喷撒有外植体的苗盘内喷晒0.01~0.1 mg/L的激动素，喷晒至基质潮湿；苗盘培养到30 d，可见白芨幼苗长出一对绿色真叶；苗盘培养到60~90 d，白芨幼苗长出3~4对真叶，此时将幼苗取出，按5 cm × 5 cm间距的间距移至大棚内进行栽种；大棚内栽种90 d，白芨幼苗茎壮根粗，此时可移栽到大田。

采用本技术方案的有益效果是：