[发明专利]一种细胞冻存液及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种细胞冻存液，包括组分及体积百分数：

无血清培养基的体积百分比为0%～50%，

自体血浆的体积百分比为40%～90%，

DMSO的体积百分比为5%～10%，

海藻糖的体积百分比为5%～10%；

各组分之和为100%。

2.权利要求1所述的细胞冻存液的配制方法，包括步骤：

1）海藻糖和DMSO按1：1的比例混匀，将自体血浆加入到无血清培养基中，使自体血浆的体积百分比为50%～100%，

2）将10%～20%的海藻糖和DMSO混合液缓慢加入，得到细胞冻存液。

3.一种提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，包括以下步骤：

1）采集外周血，分离上层淡黄色血浆层，并于56℃灭活15-30min，900-1200g离心5-10min，剩余的液体即为浓缩的血细胞，用生理盐水稀释浓缩的血细胞至原体积；

2）将细胞分离液加入离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到细胞分离液上层，血液稀释液与细胞分离液的体积比为2:1，600-700g离心15-20min，吸取离心管内的单个核细胞层，移到离心管内并补加生理盐水，洗涤并离心收集外周血单个核细胞；

3) 外周血单个核细胞的冻存：将步骤2)收集的外周血单个核细胞利用自体血浆重悬，向制得的细胞悬液中加入权利要求1所述的细胞冻存液，摇匀分装至冻存管中，放入程序降温盒中，转至-80℃后，后转移至液氮罐；

4) 外周血单个核细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从气相液氮罐中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至复苏保护液中，细胞悬液与复苏保护液的体积比为1：5-10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的外周血单个核细胞用培养基重悬，接种于培养瓶中；

5) 外周血单个核细胞诱导扩增培养：对步骤4)中培养瓶里的细胞悬液进行诱导扩增培养。

4.如权利要求书3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：所述步骤3)的冻存过程具体为：将步骤2)收集的外周血单个核细胞用自体血浆重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为0：4：1；冻存的细胞密度为5×106 /mL。

5.如权利要求3所述提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：步骤4）所述复苏保护液为1640培养基+5%人血清白蛋白，或者为PBS缓冲液+5%人血清白蛋白，或者为注射用生理盐水+5%人血清白蛋白。

6.如权利要求3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：所述步骤4)的冻存管从气相液氮罐中取出后，置于37℃恒温水浴中，并迅速溶解，转移至复苏保护液中，混匀后500g离心10min；培养瓶中接种的细胞密度为0.5×10⁶/mL。

7.如权利要求书3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：还包括步骤：

6）向步骤4)的细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，进行诱导培养CIK细胞，并按总体积10-15％的量添加自体血浆；

7）培养18-24h后观察细胞状态，并添加细胞因子CD3、CD28、IL-2，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；

8）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×10⁶cell/mL；

9）连续培养10-14天。