[发明专利]一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于骨因子制备技术领域，具体涉及了RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法。

背景技术

骨组织是由有机质和无机质组成的，主要为结缔组织，是一种动态的器官。为了维持结构的完整性，同时维持器官矿物质的平衡，骨组织必须不断地进行结构改造和修复；这个过程就是骨的重建。骨的重建主要是指骨的代谢过程，用于调整骨的结构和功能。骨的代谢过程主要涉及到两类细胞，破骨细胞和成骨细胞。破骨细胞主要涉及骨的消化，而成骨细胞在骨基质形成，细胞的矿化中发挥作用，最终分化形成骨细胞和骨衬里细胞。

成骨细胞和破骨细胞相互影响同时在各种因子的调节作用下维持骨组织的稳态。骨重建稳态的破坏将导致多种临床上的骨疾病，包括骨质疏松，骨硬化等。骨的重建过程是通过一群具有功能的细胞相互协调而完成的，这个多细胞的群体称为基本多细胞单元(BMU)。基本多细胞单元主要由破骨细胞、成骨细胞、骨衬里细胞、骨细胞、内皮细胞组成，它们通过各种细胞因子相互作用保证了骨重建的正常进行。RANKL是由成骨细胞和内皮细胞分泌的一种重要细胞因子，其在骨重建中发挥重要功能。

肿瘤坏死因子配体超家族成员11也称为核因子κ-B配体的受体激活剂、骨保护素配体、TNFSF11、RANKL、TRANCE、OPGL和CD254，是一种单程II型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族。RANKL和RANK对于破骨细胞的发育和活化以及对几乎所有测试的触发的骨丢失都是必需的。通过天然诱饵受体骨保护素(OPG，TNFRSF11B)抑制RANKL功能防止了绝经后骨质疏松症和癌症转移中的骨丢失。重要的是，RANKL似乎是关节炎骨和软骨破坏的原因。RANK-RANKL信号传导不仅激活多种破骨细胞发育的下游信号通路，而且还是与其他信号通路相互作用，在正常生理学和疾病中微调骨稳态。

核因子κB受体活化因子配体(RANKL)，其同源受体RANK和其天然诱饵受体骨保护素已被确定为破骨细胞骨吸收的最终效应分子。RANK和RANKL是骨重建的关键调节剂并调节T细胞/树突细胞通讯和淋巴结形成。此外，RANKL和RANK在乳腺上皮细胞中表达，并控制怀孕期间泌乳乳腺的发育。因此，研究如何有效制备RANKL具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种RANKL-TNF样区融合蛋白的制备方法。

本发明包括五个步骤：

步骤一、获取RANKL功能片段SEQ NO.1，RANKL功能片段SEQ NO.1含有160位精氨酸到318位色氨酸。

步骤二、利用RANKL功能片段SEQ NO.1和载体获得质粒溶液，所述的载体为pGST-4T系列载体。

步骤三、将步骤二得到的质粒溶液克隆后转化为BL21菌液。

步骤四、在IPTG终浓度为0.1～0.5mM，且温度为16～25℃的条件下对步骤三获得的BL21菌体进行诱导，得到RANKL-TNF样区融合蛋白溶液。

步骤五、对步骤四获得的RANKL-TNF样区融合蛋白溶液进行蛋白纯化。获得RANKL-TNF样区融合蛋白。

步骤一具体如下：

将SD大鼠切除卵巢造模，两周后提取其胫骨的总RNA。依照YFRAZMand AFKVR/QDID序列设计简并引物SEQ No.2和反向引物SEQ No.3，简并引物SEQ No.2的序列为5'TAYTTYMGNGCNCARATG3'；反向引物SEQ No.3的序列为5'RTCDATRTCNYGNACYTTRAANGC3'。经逆转录PCR获得RANKL的cDNA。

对所得RANKL的cDNA进行纯化操作。以纯化后的cDNA作为模板，设计出初始引物，初始引物的正向引物SEQ No.4序列为5'CCCGGGCAAGCCTGAGGCTCAGC3'；初始引物的反向引物SEQ No.5序列为5'CCCGGGTCAGTCTATGTCTTGAACTTT3'。利用初始引物克隆出RANKL功能片段SEQ NO.1。RANKL功能片段SEQ NO.1含160位精氨酸到318位色氨酸。

步骤二具体如下：