[发明专利]中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条

说明书

本发明公开一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的免疫胶体金试纸条，包括PVC底板，PVC底板上从左至右依次固定样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，硝酸纤维素膜上设有相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫标记有一种鼠抗中囊病病毒衣壳蛋白vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被另一种鼠抗vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被羊抗鼠IgG。该胶体金试纸条用于检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒，试纸条检测的特异性强，操作简便、快速，结果直观，便于推广应用。

技术领域

本发明属于病毒疫病诊断技术领域，涉及一种中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条。

背景技术

中华蜜蜂囊状幼虫病是由中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus，CSBV)引起的一种对中蜂危害严重的病毒病。其症状主要见于中蜂幼虫，病毒在幼虫体内大量复制，导致中蜂幼虫很快死亡，虫体皮下渗出液增多，用镊子夹出时呈典型的囊状。中蜂囊状幼虫病发病快、传播广、死亡率高，蜂群患病后轻者影响蜂群的繁殖和采集，重者会造成全场蜂群覆灭。该病目前尚无特效药物治疗，是中蜂现代饲养中迫切需要解决的重大问题。我国于1972年冬首先在广东省佛冈、从化、增城等地发生该病，翌年起迅速蔓延到福建、广西等12个省、区造成近百万群中蜂死亡，目前在我国中蜂养殖区基本都有流行，常造成80%-90%的损失。

中蜂囊状幼虫病病毒属于小RNA病毒科的昆虫类小RNA病毒，直径为28-30nm，沉降系数为154s，基因组是一条正链ssRNA，只有一个大的开放阅读框，翻译出多聚蛋白后剪切成结构蛋白和非结构蛋白。CSBV病毒衣壳由3种结构蛋白vp1、vp2、vp3组成，没有囊膜。

传统的对CSBV的检测主要是症状诊断、电镜观察和血清学检测等方法，而症状诊断不够确切，电镜观察和血清学检测耗时费力，而且需要繁琐的步骤和较高的试验条件，尤其是CSBV标准阳性血清难于获得，极大地限制了该病的临床检测。随着分子生物学的发展，虽然RT-PCR方法能够用于临床上CSBV的检测。但是研究表明不同地区种群的中蜂囊状幼虫病病毒核苷酸序列存在较大差异。这为设计适宜的RT-PCR引物检测不同地理种群中囊病病毒带来了很大的麻烦。但是中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的氨基酸序列高度一致，这为利用免疫学方法鉴定CSBV病毒提供了可能。而且，无论是传统的电镜观察、血清学检测方法还是RT-PCR方法，它们都要求检测者具备较高的实验条件和仪器设备，而这些正是养蜂的农户所不具备的。而基于免疫层析技术的胶体金检测试纸使用起来方便快捷，完全可以满足生产上蜂农对中蜂囊状幼虫病病毒进行检测的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的免疫胶体金试纸条，采用该试纸条检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒，检测时间短、成本低、结果易判断，实用性强，非常适合中华蜜蜂养蜂生产中使用。

本发明的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条，包括PVC底板，依次固定于PVC 板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫标记有一种鼠抗CSBV衣壳蛋白vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被另一种鼠抗vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被羊抗鼠IgG。

所述中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1、首先对中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3基因（GenBank登录号：KM232613）进行克隆、蛋白表达及纯化，获得外源vp3蛋白。

2、鼠抗vp3单克隆抗体的制备：

（a）小鼠免疫：将等体积的vp3蛋白与福氏佐剂混合乳化后，在小鼠背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，剂量为每只～50μg，以后每间隔3周免疫一次，剂量同第一次，连续免疫2次，第二次免疫加福氏不完全佐剂，第三次免疫不加佐剂，第三次免疫2-3周后通过腹腔注射进行加强免疫，剂量50-500μg，不加佐剂，3天后取脾细胞融合；