[发明专利]斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法

说明书

本发明公开了斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法，包括DNA聚合酶链式反应，其特征在于，DNA聚合酶链式反应中所使用的引物及序列为，正向引物：5’‑GTCGACGTACTGTATCTGTGCTGATTCA C‑3’，反向引物：5’‑GACCAGAAGAGATAATTCAAACG T‑3’。本发明要解决的技术问题是为椎间盘退变研究提供理论基础的斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法。

技术领域

本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法。

背景技术

随着年龄的增长、压力磨损的累积所引发的椎间盘退变是脊柱特有的衰老性疾病，可引发20％的下腰痛(low back pain，LBP)，椎间盘退变是慢性下腰背痛发生的主要病因。椎间盘的发生发育、退变和再生修复是一个复杂过程，确切分子生物学机制尚不明确，涉及到许多方面的影响因素，有待于进一步研究。椎间盘脱出症、腰腿痛、颈椎病等作为临床的常见病和多发病，其发病机理直接与椎间盘退变密切相关。研究椎间盘的退变机制和修复机理，可为该类疾病的预防和治疗提供正确的理论依据，并随即制定行之有效的防治方案，从而降低发病率，提高治愈率，改善患者的生活质量。

目前对于脊柱退行性疾病研究比较普遍的是通过手术方式来损伤小鼠腰椎椎间盘为主的方式来建立椎间盘退变的动物模型，但是这种建模的缺陷是非常明显的，比如手术创伤大，经济成本高，而且小鼠胚胎在母鼠体内发育，不利于脊柱早期发育进展的研究，不适用于活体上实时动态标记细胞的迁徙、分化过程，所以我们认为小鼠为首选的哺乳类动物模型的代表性一般。Hayes等已经将斑马鱼作为老龄化脊柱畸形研究的动物模型，通过描述年龄相关性的变化，伴随椎骨发生类似骨关节炎的特性，特别是椎骨软骨与骨组织，这些有助于在动物模型中进行脊柱畸形的研究。通过研究新型实验动物模型，使得我们能够更好的去理解脊柱退行性疾病的病变过程，以此作为改进现有的临床治疗方案提供更坚实的基础。以上研究说明斑马鱼是一种研究脊柱骨骼发育以及相关疾病的新型动物模型，特别是在脊柱退行性疾病研究中有巨大潜力。尽管斑马鱼作为一种新兴的模式生物还未被广泛应用于脊柱发育及相关疾病的研究，但完全可以弥补小鼠模型的缺陷与不足。斑马鱼这类广泛应用于科学研究的新型模式生物，与人的基因同源性高达87％，具有胚胎透明和体外发育、方便的正向和反向遗传的研究手段；尤其是脊柱与哺乳动物结构组成相似，在脊柱发育过程中的相关信号调控有很高的同源性。利用Cre/Loxp系统可在斑马鱼活体上实时动态观察细胞的迁徙过程，Enu大规模正向遗传筛选，可筛选出突变引起脊柱骨骼发育畸形的斑马鱼。这些优势使得斑马鱼成为脊柱骨骼的发育机制、生物矿化研究的理想模式动物。

本发明是以斑马鱼作为模式动物，通过损伤斑马鱼椎间盘来构建椎间盘退变模型，为进一步研究椎间盘退变与椎骨退变的分子机制提供初步的理论基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为椎间盘退变研究提供理论基础的斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：斑马鱼椎间盘损伤模型的构建方法，包括DNA聚合酶链式反应，DNA聚合酶链式反应中所使用的引物及序列为：

正向引物：5’-GTCGACGTACTGTATCTGTGCTGATTCAC-3’

反向引物：5’-GACCAGAAGAGATAATTCAAACGT-3’。

进一步，所述的DNA聚合酶链式反应的反应体系为：

进一步，所述的DNA聚合酶链式反应的反应过程为，

a、98℃预变性2min

b、98℃变性10sec

c、58℃退火15sec

d、72℃延伸5min30sec

b～d重复35个循环