[发明专利]一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法

说明书

本发明公开了一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)将线虫接种植物，进行培养；(2)完成步骤(1)后，取植物根组织，观察线虫在植物根组织中的发育状态；(3)完成步骤(1)后，取植物根组织，对植物根组织中的线虫进行计数；综合上述结果判断植物对线虫的抗性。本研究将甲苯胺蓝应用于根结石蜡切片的染色，找出最佳染色时间，可以很清晰的观察到线虫和巨细胞的发育状态，而且染色时间比较快，效果比较好。针对线虫个数的统计，将研磨法和过筛法结合起来，找出最佳的研磨时间，方便根中线虫个数的统计。这两种方法结合起来应用，可以从线虫的发育状态和线虫的个数两个方面说明植株对线虫的抗性。

技术领域

本发明涉及一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。

背景技术

近年来根结线虫病在设施蔬菜栽培中越来越严重。根结线虫是一种专性寄生线虫，在植物组织中完成它们的生活史。二龄幼虫(J2)从接近分生区部位进入植物组织，向着根尖的中柱移动。伴随着根尖细胞的发育和伸长，其可以迁移到根的成熟区，找到合适的取食位点后，定居下来发育成为三龄幼虫(J3)，刺激头部周围的4-5个薄壁细胞形成大型多核的、新陈代谢活跃的巨细胞，并逐渐形成适合自己生活需要的维管组织，以便于其从巨大细胞中摄取植物营养，直至发育为成虫。雄虫会离开取食位点，雌虫会产卵。卵块会继续孵化成J2，再次侵染植物的根组织。在寄主植物和线虫长期互作的过程中，宿主植物会有某些防御措施来抵抗线虫入侵或破坏线虫的发育。

为了观察根组织中的线虫发育情况，常常用一些染色剂对根组织直接进行染色，例如棉蓝和乳酚，但是，用这类染色剂染色时，操作起来比较复杂，同时也是操作人员长期接触一些有毒的酚类物质。随后研究人员开始用番红-固绿对根结的石蜡切片进行染色，同时可以观察线虫和巨细胞的发育情况。但是，用番红染色一般需要8个小时，染色时间较长。线虫的个数统计，一般用贝曼漏斗法或蔗糖离心法来分离根组织中的线虫，但是贝曼漏斗法的分离效果比较低，不适宜用于线虫个数的统计。蔗糖离心法的糖耗比比较大，而且对仪器设备要求比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定植物对根结线虫抗性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了甲苯胺蓝作为染色剂在观察线虫在植物根组织中的发育状态中的应用。

本发明还保护一种观察线虫在植物根组织中的发育状态的方法，包括如下步骤：采用甲苯胺蓝作为染色剂，用含有线虫的植物根组织制作石蜡切片并进行染色，然后在显微镜下观察。

所述方法中，采用1％(体积百分比)甲苯胺蓝水溶液对所述石蜡切片进行染色。

所述染色的时间为10-15min。所述染色时间具体可为10min。

具体来说，所述染色程序依次为：(1)将所述石蜡切片置于1％(体积百分比)甲苯胺蓝水溶液中，室温10min；(2)将所述石蜡切片置于蒸馏水中，室温15min；(3)将所述石蜡切片置于乙醇中，室温2min；(4)将所述石蜡切片置于1体积份二甲苯和1体积份乙醇的混合溶液中，室温1min；(5)将所述石蜡切片置于二甲苯中，室温1min。

所述石蜡切片的制作方法依次包括如下步骤：固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烘片和脱蜡。

所述固定具体可为将所述植物根组织置于FAA固定液中固定24h。

所述脱水具体可为将固定好的材料依次加入70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液和100％乙醇中进行梯度脱水(每个梯度30min)。

所述透明具体可为将脱水后材料加至由1体积份无水乙醇和1体积份二甲苯组成的混合液中浸泡30min，然后转移至二甲苯中浸泡30min，使材料呈透明状。