[发明专利]猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和生物工程领域，具体涉及猪肌抑素基因编辑位点及其应用。

背景技术

基因转移技术根据外源基因整合的位点特异性可分为两大类，一类是非定点的，即导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，包括显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等：另一类则是定点的，即外源基因导入靶细胞后整合到预先确定的位点或对细胞内靶位点进行定点修饰，这就是依赖于同源重组的基因打靶技术。将外源基因精准敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到很大的限制。直到近年来人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。

锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)是第一代人工核酸内切酶。锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，很多转录因子中都含有锌指结构。ZFN是将锌指蛋白的DNA结构域和FokI核酸内切酶中的非特异性的DNA切割结构域组合形成的一种嵌合体蛋白，其既具有锌指蛋白结合DNA的能力又具有核酸内切酶FokI切割DNA双链的能力(Kim Y G,Cha J,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokI cleavage domain.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于猪、牛、大鼠、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、海胆、拟南芥、烟草、玉米等生物(Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nat Rev Genet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制备流程复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司所控制，所以推广应用十分有限。

2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector,TALE)与DNA的碱基对应关系解密(Moscou M J,Bogdanove A J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,2009,326(5959):1501；Boch J,Scholze H,Schornack S,et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science,2009，326(5959):1509-1512.)。第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)应运而生。和ZFN相似，TALEN主要由TALE蛋白的DNA结合结构域和Fok I核酸内切酶结构域组合而成，TALE蛋白含有多个33-35个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。2010年，首次报道TALEN蛋白在酵母中应用成功(Li T,Huang S,Zhao X,et al.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic acids Res,2011,39(14):6315-6325.)。之后，TALEN在植物、小鼠、斑马鱼、猪、牛等动植物中得到了迅速的推广与应用(Joung J K,Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55.)。TALEN不仅可以像ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，而且其构建更加简单，特异性也更高，因此TALEN出现不久就在很大程度上替代了ZFN。2012年，TALEN被《科学》(Science)杂志评为十大科学突破之一(Breakthrough of the year.The runners-up.Science,2012,338(6114):1525-1532.)。