[发明专利]一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺

权利要求书

1.一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于所述工艺包括以下步骤：

1)天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行Ser-137、uv-B诱变，低温4℃处理，将MS培养基的含糖量提高至50-100g/L后作为筛选培养基，以筛选培养基反复进行筛选获得细胞系，进行细胞系筛选时的培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，每两周继代一次；

2)摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，颜色鲜亮，质地紧实的固体细胞放入含有培养液的摇瓶中，培养液为含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS生长培养基，所述MS生长培养基的含糖量为20～40g/L，细胞接种量为30～50g/L，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，摇床转速为100-120rpm，每7-10天继代一次；

3)摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7-10天，反应器中加入培养液，所述培养液为含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS培养基，所述MS生长培养基的含糖量为20～40g/L，培养条件为23-25℃，光周期为16h/8h，光照强度为1000-3000Lux，通气保持反应器中培养液的溶氧浓度在2-6mg/L。

2.如权利要求1所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)中，每次继代培养细胞鲜重翻倍量为3-5倍，培养完成时细胞鲜重不低于150g/L。

3.如权利要求1～2任一所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)中，反应液中培养液的溶氧浓度保持在2～4mg/L。

4.如权利要求1所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于所述反应器为带有曝气装置的波浪回头式生物反应器。

5.如权利要求4所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)摇瓶转反应器培养包括以下步骤

3.1)摇瓶转20L反应器继代培养，将摇瓶细胞无菌接入20L反应器中，接种量为30～50g/L，保持反应器振频为5-15rpm，通气量为0.1-0.3m³/h；

3.2)20L转200L反应器继代培养，在20L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接入200L反应器中，保持反应器振频为10-20rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为0.4-1.0m³/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高5-10个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L；

3.3)200L转1000L反应器继代培养：在200L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将200L反应器中完成继代的细胞种源转接到1000L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为10-15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15-25rpm；并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为1.5-4.0m³/h，混合气体的初始氧气比例为零，随着培养过程梯度增加氧气比例，每次将氧气占混合气体的体积百分比含量提高10-20个百分点，将溶氧浓度控制在2mg～6mg/L。

6.如权利要求5所述的一种大规模继代培养天山雪莲细胞的工艺，其特征在于步骤3)中，反应液中培养液的溶氧浓度保持在2～4mg/L。