[发明专利]一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术领域，进一步涉及植物细胞规模化培养过程中次级代谢产物的诱导表达，具体涉及一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法。

背景技术

植物细胞培养技术是以离体植物细胞或原生质体为对象，以细胞量扩增和目标代谢产物累积为目的的培养工艺。对于以获得特定代谢产物为目的的细胞培养而言，其主要工艺环节不仅在于细胞量的扩增，同时，目标代谢产物的诱导合成对培养效益更为重要。在植物细胞的培养过程中，培养条件和营养条件是影响产量的最重要因素，其中培养条件是指温度、溶氧、光照、pH等环境条件的控制，而营养条件主要指植物细胞的培养基。

天山雪莲又名雪莲、天山总苞雪莲，为菊科凤毛菊属植物，是我国高山地区的一种稀有名贵的中药材，含黄酮、生物碱、多糖等多种有效成分，具有活血通经，散寒除湿，强筋壮阳等功效，多用于风湿性关节炎、经血不调、阳痿、跌打损伤的治疗。但雪莲生长环境特异，生长周期长，人类长期的盲目采挖，已使雪莲的自然资源近于枯竭，通过悬浮培养来生产雪莲的有效成分，既可保护野生资源，又可以满足日益增长的中药需求。然而雪莲细胞培养条件苛刻，对营养要求高，现有技术的离体悬浮培养技术尽管取得了一定的进展但目标产物雪莲黄酮的产量始终处于较低水平。

在雪莲细胞培养的研究中，如何提高培养物中的主要有效药用成分黄酮的含量和质量，扩大培养规模，最终实现工业化生产，是这一领域的研究重点。国内外研究者在雪莲愈伤组织培养、细胞悬浮培养、发酵培养等方面做了大量工作，然而目前雪莲细胞的培养效果以及总黄酮的产量仍有待提升。

天山雪莲难以人工种植，资源受到迫害，供不应求；植物细胞培养方面细胞株不稳定，次级代谢产物产量低，大规模生产难。目前在天山雪莲大规模技术培养方面报道较少，只涉及到10L左右的反应器，且无两阶段培养技术在雪莲细胞生产黄酮方面的应用，调控技术应用少等，致使现在缺少一种稳定高产且快速的大规模培养天山雪莲细胞的调控工艺。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，以解决现有技术的天山雪莲细胞培养方法所得的黄酮产量较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的天山雪莲细胞培养方法难以规模化放大。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种规模化培养天山雪莲细胞高产黄酮的调控方法，包括以下步骤：

1)取天山雪莲细胞接种于液体生长培养基中，以温度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度1000～3000lux的条件培养，每7～10天传代一次，直至培养液中细胞鲜重达初始细胞接种量3～5倍；

2)取步骤1)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重30-80g/L的接种量接种于液体生长培养基中，以温度20～25℃，100～130rpm的转速摇床培养5～8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150～400g/L的接种量接种于液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000～3000lux，100～130rpm的转速摇床培养1～4天；

3)取步骤2)培养所得的天山雪莲细胞，以鲜重50～100g/L的接种量接种于液体生长培养基中，以0.01～1m³/h的通气速率培养5～8天；从产物中取天山雪莲细胞，以鲜重150～300g/L的接种量接种于液体生产培养基中，以24h全光照，光照强度2000～3000lux，0.01～1m³/h的通气速率培养1～4天；

其中所述生长培养基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、20～40g/l蔗糖的MS培养基；

所述生产培养基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、0.1～100μmol/l苯丙氨酸、0.5～10μmol/l冠菌素、15～25g/l蔗糖的MS培养基。

作为优选，步骤1)中用于接种的天山雪莲细胞是通过以下方法获得的：取天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞利用Ser 137γ射线、uv-B诱变，而后0-8℃处理，再利用含蔗糖50-100g/L的MS固体培养基，以温度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照强度1000～3000lux的条件反复培养，筛选获得天然雪莲细胞系。

作为优选，步骤1)中所述反复培养的过程中，每两周继代一次。