[发明专利]一种修饰的增强型靶向免疫细胞群的制备方法和用途

权利要求书

1.制备一种用于修饰DC-CIK细胞的慢病毒，其特征在于包含PD-1胞外区及跨膜区核酸序列，胞外区与跨膜区之间用linker序列相连，如 SEQ ID NO ：1 所示，以及白细胞介素-2（IL-2）核酸序列如SEQ ID NO ：2所示，SEQ ID NO ：1与SEQ ID NO ：2中间以IRES序列如SEQ ID NO ：3所示进行连接，所构成的完整序列如SEQ ID NO ：4所示，该病毒可在感染细胞后在细胞表面表达PD-1胞外区并分泌IL-2蛋白，其蛋白序列和SEQ ID NO ：5与SEQ ID NO ：6所示，用于多种肿瘤的治疗。

2.根据权利要求 1 所述的方法，所述病毒是通过以下步骤获得的：制备PD-1胞外区及跨膜区-IRES-IL-2核酸序列，将所述序列连入商业化慢病毒载体，以pWPXL系统为例，其中包括但不限于该慢病毒系统，进行载体构建，通过磷酸钙转染的方法，进行病毒包装，收获的病毒经纯化后备用。

3.根据权利要求 1 所述的方法，所述DC-CIK细胞是通过以下步骤获得的 ：一种制备DC-CIK 细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：从外周血中分离淋巴细胞，再通过贴壁处理进行区分，贴壁细胞经过诱导分化培养每 2-3天半换液一次，以便获得未成熟的 DC 细胞；4-5 天，收获细胞，将制备的肿瘤抗原灭活后与孵育共培养，并进行进一步诱导分化培养， 2-3天以便获得成熟的致敏的DC 细胞；未贴壁的细胞经过诱导培养，每 2-3 天半换液一次，以便获得CIK细胞；将培养7天的CIK细胞加入5x10⁸病毒，共培养12小时；DC与修饰的CIK1:5混合共培养制取Triumph-DC-CIK细胞将负载肿瘤抗原的DC和培养至5-7天的修饰后CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用VIVO-15无血清培养液调两细胞的密度分别为2x10⁵和1x10⁶，按DC：CIK=1:5等体积混合后移入25cm²培养瓶10ml/瓶，于37℃，5%CO₂培养，每隔2天等量补液一次；，每隔 3 天分瓶扩大培养1次，经2次扩大培养后，即可获得5x10⁹~1x10¹⁰的Triumph-DC-CIK细胞。

4.根据权利要求1所述的肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质瘤和乳腺癌。

5.处理个体中其包括步骤：用包含根据权利要求1所述的一种修饰的DC-CIK靶向性免疫细胞群。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述个体已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法，其中额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫治疗或激素治疗。