[发明专利]一种捕获核酸结合蛋白的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及捕获RBP的方法以及相应的试剂盒，所述方法包括将核苷类似物A加入到可合成RNA的生物样品体系中；光激活处理，使RNA与蛋白发生光交联；加入细胞裂解液，加入第一分子B；获取生物样品体系的内容物；将内容物与带有标记分子C的载体D接触；分离载体，获得RNA‑RBP复合物。本发明所述试剂盒能够更广谱地捕获RNA及其RBP，解决现有技术无法获取nonpolyA‑RBP的局限性。可高效富集RBP，且特异性好，不会捕获非RBP蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地是涉及一种捕获核酸结合蛋白的方法和试剂盒。

背景技术

nonpolyA-RNA(包括circRNAs、ppRNAs，eRNAs，tsRNAs等)与多种生理生化过程相关，如转录调控和mRNA翻译等。nonpolyA-RNA通常以与RNA结合蛋白(RNA-bindingproteins，RBPs)形成蛋白复合物的形式发挥作用，RBP参与RNA剪接、多聚腺苷化、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译调控等RNA代谢的各个方面。为研究nonpolyA-RNA与其RBPs的互作组学，分离与鉴定nonpolyA-RNA与其RBPs是不可或缺的研究方法，需要能有效分离nonpolyA-RNA与其RBPs的技术手段。而现有的RBPs分离技术无法实现有效获取nonpolyA-RBPs的目的，如Oligo(dT)技术(Castello,A.et al.Insights intoRNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.Cell 149,1393-1406(2012))。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的捕获RBP的方法，该方法在RICK方法的方法创新并进行了改进。本发明所述方法在研究RNA与RBP的互作组学上具有重要价值，同时有利于发现新的RBP，新的RBP的功能与其调控机制，可广泛应用于疾病机理研究、药物靶标筛选等领域。

实现上述目的技术方案如下。

一种捕获RBP和/或RNA的方法，主要包括以下步骤：

1)将带有亲偶极基团的核苷类似物加入到可合成RNA的生物样品体系中；

2)光激活处理，使RNA与蛋白发生光交联；

3)加入含有1，3-二偶极基团的第一标记分子的点击反应液，通过点击反应将第一标记分子与掺有核苷类似物的RNA共价连接，使RNA被第一标记分子标记，所述点击反应为亚铜离子催化下的Huisgen三唑反应，点击反应液中包括有催化剂，所述催化剂优选为一价Cu⁺或Vitamin C和Cu²⁺的组合；

4)加入细胞裂解液，至样品溶液澄清，所述细胞裂解液包括有0.15M-1M的Li盐和去垢剂，所述去垢剂优选为0.1-1％的含锂离子的去垢剂；

5)加入连接有载体的第二标记分子，第二标记分子能与第一标记分子结合反应，通过第二标记分子与第一标记分子的结合反应，将所形成的RNA-蛋白复合物偶联至带有第二标记分子的载体上；

6)分离获得载体上的RNA-蛋白复合物；

7)分离获得RNA-蛋白复合物中的蛋白(RBP)和/或RNA。

在其中一个实施例中，所述点击反应液中加入有蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为氨基胍和/或THPTA。

在其中一个实施例中，所述蛋白保护剂为0.3-1.5mM的THPTA和0.5-1.5mM的氨基胍。

在其中一个实施例中，所述细胞裂解液包括有0.45M-0.5M的LiCl和去垢剂，所述去垢剂优选为0.5-1％的LiDS(0.5-1g LiDS溶于100ml水中)。