[发明专利]一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物医药领域，具体涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是临床上较为常见的难治病症，以黑质多巴胺能神经元变性缺失以及路易小体形成为主要病理特点，临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常，极大影响了患者的生存质量。从19世纪60年代晚期开始，通过口服左旋多巴的多巴胺替代疗法来缓解PD运动症状是现代神经科学转化研究中的成功之一。目前，左旋多巴仍是治疗有症状PD的金标准。PD治疗目前最为有效的方法是采用左旋多巴替代治疗，但仍不能有效阻止或减缓疾病的发展。目前只能采用药物、外科手术或电极的方式进行缓解和控制症状，避免发展速度过快。

自二十世纪八十年代初开展的细胞移植治疗PD以来，人们已尝试过胚胎中脑黑质组织、自体肾上腺髓质，胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、人畸胎瘤神经元等，并取得了一定的疗效，因此细胞移植治疗PD也越来越多的受到关注。但上述细胞来源均受供体(donors)资源匮乏、伦理问题、成瘤风险大、免疫排斥反应、诱导多巴胺能神经元比例低等问题困扰，限制了细胞移植治疗帕金森病的进程。

目前临床治疗帕金森病的方法以口服DA前体药物左旋多巴为主，但这种药物起初有效，长期服用则会出现疗效下降，并引起一系列运动障碍并发症。外科治疗以苍白球和丘脑的损毁为主要方法，但术后复发率高。上述方法属于对症治疗，但不能逆转DA能神经元的变性，因此，找到一种能够替代变性的多巴胺能神经细胞以恢复多巴胺神经递质功能的新技术新方法，已成为迫在眉睫的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。

本发明与鼠神经生长因子等神经营养药不同，神经干细胞注射液来源自人类胚胎(通过伦理审查)，完全100％人源，并且采用鼻腔无创给药的方式，直接作用于中枢神经系统，预计对小儿脑瘫将有更好的疗效。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂，所述方法包括如下步骤：

S1：种子细胞培养与纯化：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P5代即为获得的种子细胞。

原代神经干细胞可以是在显微镜下使用手术器械分离获得废弃胎脑的腹侧中脑组织，然后采用消化液将细胞进行消化，细胞计数后使用无血清完全培养基进行重悬，并接种于超低吸附培养瓶中，35℃5％CO2培养箱中进行悬浮培养，每间隔48-72小时进行换液，细胞连续培养12天左右即可传代，连续培养至P5代，在P0代到P5代这个过程里，所得的细胞越来越纯。将所得的P0-P5代细胞放入种子细胞库中进行存储。

本发明所述神经干细胞可以是不同动物例如哺乳动物例如灵长类动物例如人、啮齿类动物例如鼠等的神经干细胞，而且所述神经干细胞可以得自不同来源，例如可以商购获得的神经球冻存液或神经干细胞细胞系，或者是间充质干细胞向神经方向诱导获得的神经干细胞；或者是由其他来源经诱导分化而来的神经干细胞，比如iPSC技术，胚胎干细胞(包括极小类胚胎干细胞)，亚全能干细胞，人类视网膜色素上皮细胞等；或者是除神经组织器官以外的其他器官及组织而来的神经干细胞，比如脐带血和脐带。

S2：P6—P8代细胞培养：将步骤S1中得到的P5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至P8代。

所述培养扩增传代的方法为将细胞培养瓶采用层粘连蛋白Laminin在37℃包被2小时，然后采用不含Ca、Mg的DPBS洗涤一遍备用；将P5代神经干细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x10⁵个/ml，接种于包被好的培养瓶中，置于35℃5％CO2环境进行贴壁培养；细胞培养每间隔48小时进行换液，细胞连续培养7天左右即可传代，直至P8代，期间P6-P8细胞放入主细胞库进行存储。

S3：工作细胞库：取步骤S2中P8代细胞，进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用。

优选的，步骤S2中所述无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF,EGF,LIF组成，无任何动物源血清成分。