[发明专利]基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂

说明书

本发明涉及基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂，揭示了一种新型的制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，该方法包括培养活细胞使得活细胞内积累甜菜碱、之后再进行冻干的步骤。本发明的方法可以极为显著地提高活细胞在冻干后的存活率以及细胞活力，弥补了以往疫苗冻干制剂配体系统无法有效保护疫苗株胞内生理代谢功能不受损伤的不足，有效发挥了疫苗株胞内外不同保护剂的协同效应。

技术领域

本发明属于生物制品冷冻干燥领域；更具体地，涉及基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂。

背景技术

制备具有稳定生物活性生物制品的一个可行途径就是将其制备成干燥的固体剂型。目前在生物医药领域尤其是疫苗产品制备中最为广泛采用的干燥技术是冷冻干燥法(freeze-drying)，此干燥制备技术具有成本低、加工过程易于控制和制备可接受性符合产品技术要求等优势(Anamur C.et al.,2015,Int J Pharm,483(1):131-141)。成功的冷冻干燥制剂取决于两个方面：1)冻干加工过程；2)冻干物料系统及配制。对于活细胞疫苗制品来说，除了疫苗产品制剂稳定性挑战外，还面临加工过程中低温冷冻及干燥胁迫对细胞存活力(Cell Viability)的损伤，进而影响疫苗产品中活细胞的存活率(Survival Rate)和免疫剂量。

冻干制剂的物料系统主要由各种赋形剂构成(如糖类、氨基酸、聚合物、表面活性剂、盐类等)，在冷冻干燥加工制备过程中发挥对冻干制剂中的生物活性蛋白或细胞等组份的保护与稳定功能，并在冻干产品的储藏阶段中维护这些活性组份的结构完整性，从而确保冻干制剂具有符合商业应用需求的货架期。对于活细胞生物制品而言，冷冻干燥过程中的低温(-40～-50℃)和干燥脱水及干燥导致的高浓度溶剂渗透压对细胞膜的结构完整性及细胞生理功能将造成极大胁迫压力。为应对这些胁迫损伤，许多冷冻保护稳定剂被添加进冻干制剂物料系统中，常见的有糖类(如蔗糖、海藻糖、葡聚糖等)及氨基酸类(如甘氨酸、谷氨酸盐等)。

接种疫苗已经成为国际上防治病害、感染的有效防治措施(Brudeseth B.E.etal.,2013,Fish Shellfish Immunol,35:1759-1768；Gould C.,2003,Skretting Outlook,20:10-11)。在冻干过程中较低的细胞存活率一直是包括鱼用疫苗在内的冻干活疫苗产品制备开发中的制约性瓶颈之一(Lal M.et al.,2013,Vaccine,31:4759-4764；PowellD.B.et al.,2009,Cryobiology,59:158-163)，它直接降低了单位接种量中的有效剂量(疫苗活细胞数)，导致接种量增大，接种成本增加。

例如，目前国内外市场上已商品化的鱼用鳗弧菌疫苗均为灭活液体制剂，基本采用腹腔注射方式免疫接种。而减毒活疫苗(live attenuated vaccine)因可在鱼宿主体内增殖而同时激发体液和细胞免疫应答反应，相比灭活疫苗具有更好的免疫效力，并可通过浸泡方式免疫接种，无疑对于水产养殖业具有接种便利和给药成本低廉的独特给药操作优势，成为鱼类疫苗的一个热点开发策略(Ellis R.W.,2001,Vaccine,19:2681-2687)。

上述提及的一些冷冻保护稳定剂在许多冻干制剂制备中发挥了较好的冷冻保护作用，但在一些活细胞疫苗例如鳗弧菌疫苗的制备中却没有呈现出商业开发可接受的细胞存活率。虽然配合冷冻干燥加工过程优化，鳗弧菌活细胞存活率有了一定改善，然而仍不能达到其它细菌性活细胞的冻干存活率(至少70％以上)。

发明内容

本发明的目的在于提供基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂。

在本发明的第一方面，提供一种制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，所述方法包括：

(1)培养活细胞，所述的活细胞是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞；培养时添加甜菜碱或添加诱导该细胞胞内合成甜菜碱的前体物质，使得活细胞的胞内合成或转运积累甜菜碱；