[发明专利]葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法

权利要求书

1.葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法，包括下述步骤：

1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14天；

2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，11400g离心8min；

3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccum parvum或Diplodia seriata。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产毒液体培养基为改良Fries产毒液体培养基，所述改良Fries产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。

4.一种利用权利要求1所述的粗毒素原液的进行葡萄溃疡病菌对葡萄致病力评价的方法，包括下述步骤：

1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；

2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm离心8min；

3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液；

4)选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1至第4片叶子，用质量百分浓度为1％次氯酸钠溶液进行消毒处理1min后，用灭菌水冲洗3遍，超净工作台中晾干备用；

5)用直径为1cm的打孔器在经步骤4)处理的叶片上打取叶盘，并将其放入装有润湿灭菌滤纸的培养皿中；

6)用移液器吸取步骤3)中制备的10μm粗毒素原液，接种在步骤5)中所述的叶盘的中心位置，25℃保湿培养3d后根据病斑面积大小评价不同葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、小新壳梭孢Neofusicoccum parvum或Diplodia seriata。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述产毒液体培养基为改良Fries产毒液体培养基，所述改良Fries产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄品种为‘夏黑’、‘寒香蜜’或‘巨玫瑰’葡萄品种。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1片叶子。