[发明专利]一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，其重链可变区序列包含SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。本发明以人角蛋白18(CK18)的胞外区多肽为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，得到能够富集肿瘤活细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体的细胞株。本发明的抗体最大特点在于靶向CK18胞外区，提供足够的亲和力捕获表达CK18的肺癌细胞；且是第一个已知可以应用于活细胞富集捕获的CK18抗体，使之具有用于循环肿瘤细胞(CTC)捕获的潜在可能。

技术领域

本发明属于单克隆抗体生物技术领域，特别涉及一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用。

背景技术

角蛋白18(CK18)是一类角蛋白的一种，大小约为48kd；在人体单层上皮组织里面广泛表达，一般和CK8成对出现。CK8/CK18的突变可以引起多种疾病(Gastroenterology2005；129:885)。CK18是多种肿瘤诊断的血清标志物，同时也是肝损伤的血清标志物(Am JClin Pathol 2005；123:66，Clin Bi ochem 2002；35:327，J Histochem Cytochem 2005；53:229)；而CK18在乳腺癌中的低表达是不良预后的标志(Clin Cancer Res 2004；10:2670)。

进入人体外周血的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。它的捕获、鉴定在肿瘤诊断以及精准医疗指导用药中起到重要的作用。CK18是临床广泛应用的CTC鉴定标志物。目前市场中有大量产品基于抗体捕获循环肿瘤细胞，而大部分是使用抗体偶联其他磁珠等对肿瘤细胞进行富集。但未见使用CK18抗体捕获CTC的产品。市面上现有的CK18抗体，全部没有数据表明可以用于活肿瘤细胞富集，从而限制了市场上的抗体在CTC捕获这个重要领域的应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体，识别并结合人肿瘤细胞膜表面标志物CK18胞外片段的高亲和力鼠单抗，使该抗体能够应用于针对CK18蛋白的活细胞富集、分选、流式细胞术、免疫荧光、免疫共沉淀及Western Blotting。

本发明的第二目的在于提供一种上述用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体在富集肿瘤活细胞中的应用，特别是应用于捕获富集表达CK18的肺癌细胞等循环细胞。

本发明的技术方案如下：

本发明合成人角蛋白18(CK18)的胞外区多肽，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够富集肿瘤活细胞的抗人角蛋白18(CK18)的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫荧光，免疫共沉淀加质谱和活细胞杂交捕获等验证，确定最有效抗体。

一种用于捕获肿瘤细胞的抗CK18单克隆抗体，所述的抗CK18单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含SEQ IDNO.15所示的CDR3的氨基酸序列。

优选为，所述的重链可变区序列包含SEQ ID NO.4所示的CDR1的氨基酸序列、SEQID NO.6所示的CDR2的氨基酸序列和SEQ ID NO.8所示的CDR3的氨基酸序列；所述的轻链可变区序列包含SEQ ID NO.11所示的CDR1的氨基酸序列和SEQ ID NO.15所示的CDR3的氨基酸序列。